Réseaux de neurones

Etude à l’échelle de la microscopique – Etude in situ

In situ = dans le tissu

Introduction : Réseaux de neurones – généralités (neurophysiologie) :

- Comportement,

- Mouvement,

- Sensibilité,

- Pensée,

- Connaissance…

De l’ordre du mètre, de l’individu.

" Dans quelle région ? Dans quelle structure ?

Þ Techniques macroscopiques (de l’ordre du mm, voire 100 µm) :

IRM, TEP, EEG, MEG, …

La MEG (magnéto–encéphalographie) est une technique qui va remplacer l’EEG (électro–encéphalographie) est préférant l’étude de micro champs magnétiques.

Þ Etude des structures impliquées et des circuits et des connexions (qui peuvent être très longues)

Les cellules :

- Les neurones Diamètre moyen : 20 µm, mais il peut être bien plus grand

- Les cellules gliales

Neurochimie : Etude des neurotransmetteurs, des récepteurs…

Neurophysiologie : Etude du fonctionnement normal (du neurone)

" Aspect temporel et dynamique.

Questions à se poser devant un neurone :

- Son origine ? (espèce, souche)

- Sa localisation à l’intérieur du système nerveux ?

- Ses connexions ? (afférences – efférences)

- Sa neurochimie à l’instant de l’étude ? (faire attention à la chronobiologie)

- Ses messagers chimiques ?

- Ses récepteurs membranaires ?

- Les gènes qu’il exprime ?

Communications inter–neuronales :

" Messagers chimiques intercellulaires.

- Neurotransmetteurs classiques :

Quelques critères :

- Synthèse neuronale,

- Libération Ca²⁺ dépendante (exocytose dans la fente synaptique),

- Présence d’un récepteur spécifique sur l’élément post–synaptique,

- Mécanisme d’inactivation par recapture et dégradation.

Caractéristique :

- Petite molécule (soit un acide aminé, soit un dérivé d’acide aminé) produite à grâce des enzymes de synthèse.

- Chatécholamine : l’acide aminé précurseur = Tyrosine

- Sérotonine : l’acide aminé précurseur = Tryptophane

Exception :

- L’acétylcholine = choline + acétyl_CoA ; Enzyme : ChAT.

- Neuropeptides :

Exemples : Il en existe plus de 60.

- VIP (~ 40 aa),

- SP = substance P (10 aa),

- ENK = Enképhalique (5 aa),

- NPY (36 aa),

- THR (3 aa) : le plus petit.

= Séquence caractéristique d’acides aminés (= molécules plus grande que les neurtransmetteurs classiques)

" Présence également de récepteur.

Ils se localisent dans l’axone, contenus dans des vésicules à cœur dense qui viennent du soma et dérivent de l’expression d’un gène.

L’entrée dans une vésicule de l’acétylcholine par des enzymes dont le mécanisme est similaire à celui des protéines de recapture.

Enzymes : VGLUT, VAchT.

- Hormones :

- Thyroïdiennes (T3, T4),

- Surrénaliennes (cortisol, aldostérone),

- Gonadiques,

- Pancréatiques…

Problème des hormones : passage de la barrière hémato–encéphalique " Dérivé du cholestérol

- Autres messagers chimiques :

- Cytokinine,

- Anandamide (ligand endogène du cannabis)

- Prostaglandine,

- D_Sérine…

Chaque neurotransmetteur (neurotransmetteur classique, neuropeptide, hormone) présente 1 voire (comme le plus souvent) 2 à plus de 14 récepteurs.

Etude de réseaux :

Elle se fait via la microscopie optique ou électronique.

- Marquage au DAPI = intercalant de l’ADN

- Immunomarquage anti_tPA…

L’hippocampe (impliqué dans la mémoire) est subdivisé en différentes régions : CA1, CA2, CA4, Gyrus denté (CA = Corne d’Amon)

I. Prélèvements et traitements des tissus :

- Considérations bioéthiques : justification de la manipulation sur un animal + anesthésie avant l’euthanasie.

- Stéréotaxie : modèles sur des atlas stéréotaxiques " Coordonnées spatiales d’une structure.

Soit sur un tissu frais " l’échantillon peut être congelé (cellules mortes) ou non (cellules vivantes)

Soit sur un tissu fixé " mode de fixation et méthode de coupe adaptés aux techniques envisagées.

A. Le tissu frais :

- Anesthésie adaptée à la manipulation, à la problématique. Souvent en bloquant les récepteurs (des acides aminés excitateurs, par exemple),

- Euthanasie,

- Dissection.

1. Tissu non congelé :

" Survie des neurones. On peut soit isoler des cellules (mais on ne s’y intéresse pas), soit des tranches maintenues en survie.

a) Les matrices :

Une machine effectue des coupes d’ ~1 mm d’épaisseur " Tranches reproductibles.

b) Le vibratome :

Il permet des coupes de 30 à 20 µm (en général 50 µm) Il consiste en une lame de rasoir qui avance sur le tissu (par vibration) et une cuve emplie de milieu de culture ou de tampon physiologique.

Le cerveau est tenu par de la glue sur un porte–objet.

Utilisation du vibratome :

Sur tissu frais (en survie) :

- Electrophysiologie,

- Physiologie (action de substances pharmacologiques et dosages dans le milieu d’incubation des réactions neuronales),

- Etude d’activités enzymatiques (enzymes présentes dans le tissu) = histo–enzymologie,

- Traçage des voies « courtes » par injection maîtrisée du traceur.

Sur tissu fixés :

- Immunohistologie sur des coupes épaisses,

- Immunocytologie (= technique avant inclusion)

Inconvénients du vibratome :

- Les coupes sont récoltées et manipulées avec des pinceaux (peu pratique et difficile à étaler sur des lames)

2. Tissu congelé :

" Mort des cellules

Pour une congélation efficace : dépôt d’une poudre de CO₂. A –80°C, le CO₂ sous forme de neige carbonique. Au contact du tissu, le CO₂ se réchauffe et redevient en gaz (état neutre) " pas de contamination.

Les coupes de tissu au cryostat (= microtome à congélation) sont placées à ~ –20°C. L’épaisseur va de 4 à 50 µm (en général : 10 µm)

Les coupes sont collectées sur des lames (cf. TP) soit des lames classiques, soit des lames permettant la microdissection au laser. Ces dernières ont un revêtement particulier permettant une découpe ultérieure extrêmement précise de tissu frais. " Dosages de protéines, d’ARNm, …

B. Le tissu fixé :

Fixer un tissu = « Immobiliser » les cellules dans l’état où elles sont.

= Figer, mais tout en gardant l’intégrité du tissu et des cellules.

" Rester le plus proche possible de l’état physiologique des cellules.

Il existe de nombreux agents fixateurs, pour chacun, des avantages et des inconvénients.

Exemple : glutaraldéhyde, formaldéhyde, formol (= fixateur à la base de l’agent fixateur formaldéhyde), acide picrique, tétroxyde d’osmonium, acétone, froid (plus trop utilisé)

1. Les modes de fixation :

a) Fixation par immersion :

- Dissection,

- Immersion dans un fixateur (volume de fixateur 500 fois de volume de la pièce à fixer ; mais en réalité on n’en met que 100 voire 50 fois)

- Durée d’immersion à optimiser (faire attention : plus on fait agir longtemps, plus on modifie les molécules tissulaires)

Inconvénient majeur : Fixation inhomogène

La périphérie du tissu sera toujours plus fixée que le centre. Les agents fixateurs interagissent avec les 1ères molécules qu’ils rencontrent. Ils ne diffusent pas toujours facilement. C’est très important pour d’éventuelles interactions avec des antigènes (immunohistologie ou cytologie)

Nécessité d’une fixation par immersion :

Les animaux sont traités et on veut obtenir 2 types de données (données microscopiques + données biochimiques : mise en évidence d’activités enzymatiques, dosages…)

" Dissection et utilisation d’un hémisphère cérébral pour chaque recherche.

Þ Diminution par 2 du nombre d’animaux utilisés.

Cette économie n’est pas possible dans le cas d’une étude portant sur un processus physiologique latéralisé. Souvent, avant la dissection, on effectue une perfusion avec du liquide physiologique hépariné à la place du sang. L’héparine est un anticoagulant.

b) Fixation par perfusion (idéal) :

Vascularisation pulmonaire et vascularisation systématique

- Incision au niveau de l’oreillette gauche (à la pointe du cœur) et injection du liquide,

- Autre incision au niveau de l’oreillette droite (au retour veineux) pour éviter une surpression.

" Lavage de tout le système vasculaire.

j Anestésie + pneumothorax (retrait des côtes) " à faire rapidement pour éviter un arrêt cardiaque

k Injection de NaCl (liquide physiologique) hépariné, puis fixateurpar une pompe péristaltique.

Les volumes à perfuser sont à adapter en fonction de l’espèce :

- Souris : 10–15 mL de NaCl puis 50–100 mL de fixateur ;

- Rat : 20–30 mL de NaCl puis 100–300 mL de fixateur.

D Il faut toujours vérifier la pression sanguine aortique et le débit sanguin (souris : 14–15 mL/min ; rat : 80–90 mL/min)

Intérêt :

Le NaCl hépariné lave le système vasculaire. La fixation par immersion permet une dissection plus précise.

Le fixateur permet une fixation homogène.

Limite : Le respect du débit et de la pression aortique.

2. Les fixateurs classiques :

Il existe de plus de 25 fixateurs dans la littérature, néanmoins il y en a quelques uns qui sont récurrents.

- Pour la microscopie optique : PFA = 4% de formaldéhyde dans un tampon phosphate.

En solution : Formaldéhyde ; En poudre : Paraformaldéhyde % en poids/volume = 4g/100mL

- Pour la microscopie électronique : idem + ajout extemporanément de glutaraldéhyde (0,1 à 5%)

La fonction aldéhyde agit avec une fonction NH₂. Dans l’exemple d’une détection de protéine par anticorps, s’il y a trop de glutaraldéhyde, la fixation de la protéine est trop importante et l’anticorps ne peut plus se fixer dessus.

Le glutaraldéhyde est un fixateur puissant. Il n’est utilisé qu’en microscopie électronique car celle–ci consiste en un faisceau d’électron, on a besoin que le tissu soit extrêmement bien fixé.

Soit 2 tampons phosphates qui respectent l’osmolarité et le pH : 0,1 M et pH7,5

" Calcul d’osmolarité en è (=PO₄) et en Na⁺

_-Na₂ H PO₄ ; 2H₂O PM=176 " 13,35 g.L^–1

" 13,35/176 = 0,075mol de Na₂ H PO₄ Þ Autant de è et 2 fois plus de Na⁺

_-Na H₂ PO₄ ; 2H₂O PM=156 " 3,9 g.L^–1

" 3,9/156 = 0,025mol de Na₂ H PO₄ Þ Autant de è et autant de Na⁺

" Réaliser le même tampon à partir de tampon phosphate à pH7,5 :

- Coloration.

2 grands types de coupes : les coupes semi–fines et les coupes ultra–fines.

d) Vibratome :

Il effectue soit des coupes semi–fines (30 à 100 nm), soit des coupes semi–fines (1000 à 2500 nm)

II. Immunohistologie et cytologie :

A. Principes ICC et IHC :

Méthode directe Méthode indirecte

= Ac I^AIRE = Immunoglobulines (IgG) spécifiques des antigènes (Ag) recherchés. Ils sont obtenus après l’immunisation " Immunosérum polyclonaux ou anticorps monoclonaux (immunosérum = sérum d’un animal immunisé. Il est obtenu après coagulation du sang)

= Ac II^AIRE = IgG anti IgG de l’espèce qui a servi pour l’obtention des IgG spécifiques.

= Marqueur permettant une visualisation des complexes Ag–Ac lors de l’examen microscopique.

On préfère la méthode indirecte.

1. Les anticorps I^AIRE utilisés :

Ils sont obtenus en injectant un antigène dans un organisme couplé ou non à une protéine porteuse. L’utilisation d’une protéine porteuse : quand une molécule n’est pas immunogène chez l’organisme (cad : qui n’entraîne pas de réponse immunitaire) ou est déjà présente.

Exemple : On obtient quelques IgG anti BSA mais surtout des IgG anti SP.

On utilise des IgG provenant de lapin, souris, rat, mouton, cochon d’Inde, poulet, et parfois de porc.

2. Les anticorps II^AIRE utilisés :

On utilise des fragments FAB’₂ anti Ac I^AIRE :

IgG normal :

= Fragment FAB’

= Fragment FAB’₂

a) Les marqueurs radioactifs :

Ils ne sont plus trop utilisés de nos jours : c’est une technique trop lourde et de pas bonne résolution. On préfère la radioautographie. Cf poly. Elle est possible en immunologie pour quantifier un antigène à détecter. Mais on utilise plutôt la radioautographie (micro– ou macro–radioautographie)

- Micro–radioautographie : Cf. poly.

- Macro–radioautographie : Marquage de ligand " mise en évidence de récepteurs

Marquage de glucose " lors de l’activation d’une cellule, elle nécessite de l’énergie et donc utilise du glucose. On préfère utiliser du désoxyglucose qui n’est pas métabolisé " Accumulation.

Þ TEP avec du FDG (= désoxyglucose marqué au fluor radioactif)

b) Les marqueurs enzymatiques :

(1) La peroxydase :

C’est la plus utilisée. Peroxydase + Chromogène + H₂O₂ " Chromogène oxydé + H₂O

Exemple de chromogène : Le DAB, en présence de peroxydase, se polymérise et forme un précipité brun–marron, visible en MO et parfois en ME. Il est le chromogène le plus utilisé pour révéler une activité peroxidasique dans un tissu.

Le 4_chloro_1_naptol forme un précipité bleu, soluble dans les solvants organiques.

L’AEC forme un précipité rouge.

(2) La phosphatase alcaline :

Les chromogènes utilisés : BCIP–NBT " précipité bleu–noir ; BCIP–INT " précipité rouge.

Problème d’une expression large dans l’organisme (enzyme endogène) + absence de révélation dans les neurones ou des cellules gliales.

(3) La b–galactosidase :

Le chromogène : X–Gal (qui est également le substrat) " précipité bleu turquoise.

(4) Révélation des activités enzymatiques :

Cf. poly.

c) Les marqueurs fluorescents :

(1) Microscopie à épifluorescence :

On utilise une lampe à mercure qui envoie toutes les longueurs d’onde. Sur le trajet de la lampe, on place un filtre d’excitation qui va servir à sélectionner la longueur d’onde correspondant au fluorochrome (= fluorophore) qu’on cherche à exciter.

Composant fluorescent : il faut l’exciter pour q’il émette une coloration fluorescente et une longueur d’onde.

¹ Composant phosphorescent : il accumule l’énergie.

L’émission fluorescence se fait à travers d’un filtre d’émission qui ne laisse passer que la longueur d’onde correspondant au fluorophore.

(2) Les marqueurs fluorescents :

L’AMCA émet à 400nm ; la fluorexine FITC à 525nm ; la rhodamine TRITC à 650nm.

Il existe 15 fluorophores différents avec différentes longueures d’onde pour l’émission et l’absorption. Autre exemple : le DAPI (marqueur fluorescent qui s’intercale dans l’ADN) qui permet un marquage nucléaire bleu.

d) La biotine–streptavidine :

e) L’or :

Les FAB’₂ sont marqués de particules d’or de différents diamètres (1,5nm ; 5 nm ou 10–15 nm) On préfère des petites particules pour ne pas trop alourdir l’IgG.

Surtout utilisé en microscopie électronique.

B. Immunohistochimie (IHC) :

= Technique pour caractériser des cellules (à l’intérieur du tissu nerveux) en révélant la présence d’antigènes associées à tel ou tel type cellulaire et dans telle ou telle région du cerveau.

- Marquage par anticorps anti enzyme de synthèse :

Exemple : Les neurones cathécolaminergiques " mise en évidence de la Tyrosine Hydroxylase ;

Les neurones doraminergiques " TH R ; DBH £ ; PNMT £

Les neurones noradrénergiques " TH R ; DBH R ; PNMT £

Les neurones adrénergiques " TH R ; DBH R ; PNMT R

- Marquage par anticorps anti protéines de recapture sélectivement associées à la recapture d’un neurotransmetteur donné.

- Marquage par anticorps anti transporteurs vésiculaires pour un neurotransmetteur donné.

On peut caractériser un neurone par le neurotransmetteur (ou neuropeptide), par les récepteurs exprimés (cad : les messages qu’il reçoit), par certaines protéines du cytosquelette, par les canaux ioniques exprimés (propriétés électrochimiques)

Þ Multiples immunomarquages pour donner un maximum d’information sur le neurone.

1. Manipulation :

Cf. poly. Utilisation d’un tampon avec du détergent pour permettre aux anticorps d’accéder aux antigènes tissulaires par la perméabilisation de la coupe.

2. Multiples marquages en IHC :

a) Multiples marquages directs :

Cf. poly. Utilisation de cocktails d’AcI^AIRE spécifiques produits dans des espèces différentes et d’AcII^AIRE avec des fluorochromes différents (de préférence produits dans la même espèce)

b) Techniques d’élution :

Cf. poly.

C. Immunocytochimie (ICC) :

1. Généralités :

Cf. poly. Toujours sur tissu fixé.

a) ICC avant inclusion (pre–embedding) :

Cf. poly.

b) ICC après inclusion (post–embedding) :

Cf. poly.

2. Multiples marquage en ME :

Cf. poly.

3. Mise en évidence de 2 ou plusieurs antigènes sur une même coupe de tissu en ME :

Cf. poly.

a) Avant OU après inclusion :

(1) Technique « avant inclusion » :

Cf. poly.

(2) Technique « après inclusion » :

Cf. poly.

b) Avant ET après inclusion :

Cf. poly.

III. **Hybridation in situ :**

Cf. poly. = Essayer de détecter les ARNm codant pour une protéine donnée par ADNc, ribosonde, sonde oligonucléotide marquée. L’hybridation in situ peut être couplée à de l’immunohistologie (sur tissu fixé)

- Les rinçages permettent le retrait d’éventuelles hybridations non spécifiques en jouant avec la température et la concentration en sels (plus elle est élevée, plus l’hybridation est favorisée)

- La sonde chaude = avec marqueur radioactif (³⁵S_UTP) Elle ne peut pas être couplée à de l’immunohistologie (déshydratation)

- La sonde froide = utilisation d’UTP ou de TTP marqué au digoxygénine _? (UTP*^DiG)

D RNAses présentes partout : il faut tout traiter (vaisselle, ustensiles, …)

IV. Histo–enzymologie :

Cf. poly. = Révéler la présence d’une enzyme dans des cellules ou dans un tissu.

Exemples : La NADPH diaphorase " NO = gaz servant de messager chimique interneuronal par diffusion à travers la membrane.

Présence d’acétylcholine ? " Anticorps anti transporteur vésiculaire d’acétylcholine. L’acétylcholine estérase est traite : elle peut être confondue avec d’autres enzymes.

V. Traçage des voies neuronales :

Cf. poly. Un corps cellulaire peut avoir 300 000 contacts. On utilise le transport axonal (neurone vivant) ou d’autres techniques où le neurone peut ne pas être vivant.

- Injection du traceur dans la région du soma " transport antérograde jusqu’à la synapse.

- Injection du traceur dans la région de la terminaison " transport rétrograde jusqu’au soma.

Injection par iontophorèse pour les traceurs ionisé :

(Exemple pour un traceur chargé négativement)

Couplage IHC–His " caractérisation des neurones

A. Traçage in vivo :

Cf. poly.

1. Traceurs chimiques :

Cf. poly. Il s’agit souvent de lectines marquées par un fluorochrome qui ne sont pas trop spécifiques du type de transport ou de microbilles de latex (même marquage) qui sont spécifiques au transport rétrograde. Ces dernières ont un autre avantage : elles ne sont pas dégradées par les enzymes cellulaires (contrairement aux lectines)

2. Traceurs biologiques :

Cf. poly.

B. Traçage in vitro :

Cf. poly.

VI. Mise en évidence de récepteurs :

Cf. poly.

Dernières remarques…

La sérotonine est le seul neurotransmetteur classique pour lequel on a des anticorps spécifiques. Les autres sont de petites molécules et sont peu immunogènes.

La mise en évidence d’un système glutamatinergique " Anticorps anti transporteur vésiculaire.

Réseaux de neurones

Etude à l’échelle de la microscopique – Etude in situ

I. Prélèvements et traitements des tissus :

A. Le tissu frais :

1. Tissu non congelé :

a) Les matrices :

b) Le vibratome :

2. Tissu congelé :

B. Le tissu fixé :

1. Les modes de fixation :

a) Fixation par immersion :

b) Fixation par perfusion (idéal) :

2. Les fixateurs classiques :

3. Réalisation de coupes de tissus fixés :

a) Microtome (coupe à la paraffine) :

b) Cryostat (= cryotome = microtome à congélation) :

c) Ultramicrotomie – cryotomie :

d) Vibratome :

II. Immunohistologie et cytologie :

A. Principes ICC et IHC :

1. Les anticorps IAIRE utilisés :

2. Les anticorps IIAIRE utilisés :

a) Les marqueurs radioactifs :

b) Les marqueurs enzymatiques :

(1) La peroxydase :

(2) La phosphatase alcaline :

(3) La b–galactosidase :

(4) Révélation des activités enzymatiques :

Cf. poly.

c) Les marqueurs fluorescents :

(1) Microscopie à épifluorescence :

(2) Les marqueurs fluorescents :

d) La biotine–streptavidine :

e) L’or :

B. Immunohistochimie (IHC) :

1. Manipulation :

2. Multiples marquages en IHC :

a) Multiples marquages directs :

b) Techniques d’élution :

C. Immunocytochimie (ICC) :

1. Généralités :

a) ICC avant inclusion (pre–embedding) :

b) ICC après inclusion (post–embedding) :

2. Multiples marquage en ME :

3. Mise en évidence de 2 ou plusieurs antigènes sur une même coupe de tissu en ME :

a) Avant OU après inclusion :

(1) Technique « avant inclusion » :

(2) Technique « après inclusion » :

b) Avant ET après inclusion :

III. Hybridation in situ :

IV. Histo–enzymologie :

V. Traçage des voies neuronales :

A. Traçage in vivo :

1. Traceurs chimiques :

2. Traceurs biologiques :

B. Traçage in vitro :

VI. Mise en évidence de récepteurs :

1. Les anticorps I^AIRE utilisés :

2. Les anticorps II^AIRE utilisés :

III. **Hybridation in situ :**