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Rappels

 

v Notions de base :

Ø  La membrane plasmique :

§  Structure :

 

Elle représente 80% du poids cellulaire.

Elle constitue une barrière physique pour protéger la cellule.

 

Il s’agit d’une bicouche lipidique avec en son sein de :

-          Protéines disposées dans la partie externe de la membrane : les récepteurs ;

-          Protéines disposées dans la partie interne de la membrane : protéines intracellulaires, protéines G (participation à la machinerie intracellulaire) ;

-          Protéines transmembranaires (qui font que la barrière n’est pas complètement étanche)

 

Les protéines transmembranaires permettent des échanges à travers de la membrane. Ces échanges vont dépendre de plusieurs paramètres comme la nature du soluté :

 

-         Molécules hydrophobes (essentiellement des gaz)            qui traversent la membrane passivement,

-         Molécules chargées électriquement (hydrophiles) :

-          Molécules de petite taille qui traversent la membrane passivement,

-          Molécules de grande taille qui nécessitent des transporteurs,

-         Ions (= atomes de petite taille chargés) qui nécessitent des transporteurs.

 

§  Les protéines transmembranaires :

 

-          Les transporteurs :

-          Liaison à la substance d’intérêt,

-          Changement de conformation,

-          Translocation de la substance (comme le glucose)

 

-          Les canaux :

Ils permettent le passage des ions. Ce sont des protéines présentant des configurations et des structures différentes.

L’ouverture et la fermeture du canal se font par des changements de conformation.

 

Ø  Diffusion d’un soluté chargé :

 

Elle dépend de 3 paramètres :

-          La force chimique,

-          La force électrique,

-          L’état du canal.

Le canal oscille entre 2 états : soit perméant (ouvert), soit imperméant (fermé ou inactivé)

 

La force chimique consiste en la différence de concentration de part et d’autre de la membrane. On parle aussi du gradient de concentration.

 

La force électrique consiste en la différence de potentiel électrique de part et d’autre de la membrane. On parle aussi de différence de charge.

 

Þ  Ces 2 forces se combinent pour donner la force électromotrice globale. On parle aussi de Drinving force.

Même si elle est en faveur avec un passage dans un sens, le passage ne se fait que si le canal ouvert.

 

Exemple :                          La membrane est perméable au K+.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


C’est qui qui gagne ?  !!

 

Pour savoir dans quel sens se fait le passage de K+, il faut « convertir » la force chimique en un équivalent électrique.

En effet, une différence de concentration en éléments chargés doit présenter une différence de charge…

 

Soit EION, le potentiel d’équilibre de l’ion, ou force électrique équivalente, correspond à un rapport de concentration et s’exprime en mV.

 


Þ Equation de Nernst :

 

 

Par convention, on prend toujours le compartiment extracellulaire comme compartiment de référence.

 

Dans l’exemple ci–dessus, EK+ = –18 mV              La différence de potentiel : Vm = –60 mV

 

La driving force  =  Vm – EK+ = –60 – (–18)  < 0       "   Vm  <  EK+

 

"   Le passage d’ion se fait de E vers I.

 

 

            EK+ = –60 mV            

La différence de potentiel : Vm = –60 mV

 

La driving force  =  Vm – EK+

               = –60 – (–60)  = 0   

"   Vm  =  EK+

 

"   Le flux net est nul.

 

 

 

            EK+ = –78 mV            

La différence de potentiel : Vm = –60 mV

 

La driving force  =  Vm – EK+

               = –60 – (–78)  > 0   

"   Vm  >  EK+

 

"   Le passage d’ion se fait de I vers E.

 

 

 

Vm  >  EK+      "        Passage de I vers E  = flux sortant,

Vm  <  EK+      "        Passage de E vers I  = flux entrant.

 

§  Conductance :

 

C’est la facilité d’un ion à traverser la membrane. Elle s’exprime en Siemens et va de 5 à 200 pS pour un canal.

 

gIon  =  1 / R                         gIon  =  gIon . NIon . PIon

 

gIon

Conductance globale d’un ion

gIon

Conductance unitaire dans un canal

NIon

Nombre de canaux

PIon

Probabilité pour un canal d’être à l’état ouvert

 

§  Intensité d’un courant ionique :

 

Soit le courant unitaire :               iIon  =  gIon (VM – EIon)

 

Et le courant ionique global :        IIon  =  iIon . NIon . PIon

 

Soit un neurone avec un potentiel membranaire Vm = –60 mV :

 

·         [ Na+ ]EXT > [ Na+ ]INT :

Il a tendance à entrer selon la force chimique et selon la force électrique.

(L’intérieur est « plus négatif » que l’extérieur)

 

INa+  =  (VM – E Na+) . N Na+ . g Na+  =  (VM – E Na+) . g Na+

 

A l’état de repos, les canaux sont ouverts : il y a un courant Na+ entrant.

 


·         [ K+ ]EXT < [ K+ ]INT :

Il a tendance à entrer selon la force électrique. Mais il a tendance à sortir selon la force chimique.

VM – E K+ = –60 – (–84) > 0    "  Le courant est sortant.

 

A l’état de repos, les canaux sont ouverts : il y a un courant K+ sortrant.

 


·         [ Cl ]EXT > [ Cl ]INT :

Il a tendance à entrer selon la force chimique. Mais il a tendance à sortir selon la force électrique.

VM – E K+ = –60 – (–60) = 0    "  Le courant est nul.

 


·         [ Ca+ ]EXT >> [ Ca+ ]INT :

Le Ca2+ a un rôle important à la base du fonctionnement du neurone et à sa mort par une entrée massive.

Il a tendance à entrer selon la force chimique et selon la force électrique.

 

Mais à l’état de repos, tous les canaux sont fermés : la conductance du Ca2+ est nul donc il n’y a pas le courant est nul.

 

 

 

Méthode d’étude en électrophysiologique

 

v Courant imposé (= Current clamp) :

 

C’est la 1ère mesure développée. Il s’agit de l’injection d’un courant et de la mesure des variations de potentiel de membrane.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Exemple :  L’effet d’un neurotransmetteur (l’acétylcholine) sur le potentiel membranaire :

 

On impose un potentiel membranaire de base (–38 ; –42 ; –45 ; … ; –70 mV) et on applique de l’acétylcholine sur la membrane.

On mesure les variations du potentiel de membrane :

-         De –32 à –45 mV, l’acétylcholine hyperpolarise la membrane. Mais plus les potentiels de base « devenaient négatifs », plus l’amplitude diminuait.

-         L’hypolarisation disparaît pour les potentiels de base entre –45 à –47 mV.

-         De –47 à –70 mV, l’acétylcholine dépolarise la membrane. Plus les potentiels de base « devenaient négatifs », plus l’amplitude augmentait.

Þ L’acétylcholine peut induire des variations de potentiels membranaires.

 

v Voltage imposé (= Voltage clamp) :

 

Il s’agit du maintient du potentiel de membrane à une valeur donnée, puis on enregistre un courant traversant la membrane.

"  Mesure du courant macroscopique.

 

Hodkin et Huxley ont mis en place un dispositif de rétrocontrôle électronique :

-          Il contrôle la différence entre le potentiel de membrane effectivement enregistré et la valeur de potentiel désiré.

-          Il génère alors un courant pour amoindrir la différence.

"  La quantité de courant nécessaire pour maintenir le potentiel de membrane à la valeur désirée fournit un index de la perméabilité membranaire (conductance) pour un niveau précis du potentiel imposé.

 

Pour les cellules de grande taille, on utilise 2 électrodes : TEVC (Twin electrod voltage clamp)

Pour les cellules de petite taille, on utilise une seule électrode : SEVC (single electrod voltage clamp)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Vm = –60 mV

Vc = –30 mV

 

 

En général, on choisit un potentiel de maintient VH à peu près égal au potentiel de repos. On mesure un courant global.

 


                               VTEST

                                                      +20

                                                      –20

                                                      –35

       –60 = VH

 

 

v Technique de Patch clamp :

 

Neher et Sakmann ont développé une variante du voltage imposé.

Il s’agit d’une technique de mesure d’un courant ionique à travers d’une portion de membrane (quelques canaux ioniques, voire un seul)

"  Mesure d’un courant élémentaire (unitaire) ou d’un courant macroscopique (global)

 

On enregistre des sauts de courant survenant lorsque, à potentiel constant, l’état d’un canal ionique se modifie, passant d’un état non conducteur à un état conducteur.

 

-          La pipette (préalablement polie à la chaleur) entre en contact avec la membrane (elle–même préalablement traitée aux protéases pour enlever la MEC, la rendant lisse)

-          On crée une aspiration, formant ainsi un contact extrêmement serré entre l’orifice de la pipette et le fragment de membrane.

 

 

 

 

Succion

 

 

 

 

 


La résistance du contact est de l’ordre du gigaOhm (» 100 GW)

L’étanchéité du contact (ou seal) a 2 conséquences :

-       La résistance du courant entre l’intérieur de la pipette et le milieu extracellulaire est tellement forte que les petits changements en résistance provoqués par l’ouverture et la fermeture des canaux dans la membrane peuvent être détectés grâce à un système d’amplificateur.

-       Il est possible de mesurer le courant ionique selon différentes configurations.

 

L’établissement du seal va déterminer la qualité de mesure :

-          Le bruit de fond doit être le moins important,

"   Le rapport signal/bruit dit être le plus élevé.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


                                                                                                     Seal de l’ordre du :

                                                                                                 MW                    GW

 

 

 

 

 

 

 

Ø  Configuration Cellule–attachée (cell attached) :

 

L’activité d’un seul canal peut être étudié. Il n’y a que le seal installé.

"  On travaille dans des conditions d’intégrité de la cellule.

 

"  Mesure de l’activité du courant élémentaire (unitaire)

 

Ø  Configuration Cellule–entière (whole cell) :

 

Une fois le seal installé, on crée une aspiration plus forte. Il y a alors la cassure de la membrane emprisonnée à l’intérieur de la pipette. Cela crée une voie de faible résistance à l’intérieur de la cellule.

Le milieu intrapipette et intracellulaire sont mélangés.

 

"  Mesure d’un courant global qui traverse le reste de la cellule.

 

Cette technique est moins traumatisante que l’introduction d’une électrode de mesure, dans le cas de la technique de voltage imposé.

 

Limite de cette technique :

Il existe une probabilité de perdre certains constituants de la cellule. Cela peut influencer l’activité des canaux ioniques.

 

Ø  Configuration Patch–perforé :

 

Elle consiste en la formation de pores dans le patch sous la pipette, par des antibiotiques (comme la nystatine) Mais le patch devient poreux et peut casser facilement.

Ø  Configuration Inside–out :

 

Grâce à la solidarité du joint, la pipette peut être utilisée pour enlever un fragment de membrane :

-          A partir de la configuration Cellule–attachée, on remonte doucement la pipette,

-          Il y a cassure de la membrane et formation d’une vésicule autours de la pipette, dont la surface externe peut être cassé en sortant pipette à l’air libre.

 

"  La surface cytoplasmique est au contact de la solution externe.

Þ  Etude du rôle des substances et facteurs qui agissent sur le coté intracellulaire de la membrane sur le canal ionique.

 

"  Mesure du courant unitaire du canal piégé dans le fragment de membrane.

 

 

 

 

 

 

Ø  Configuration Outside–out :

 

-          A partir de la configuration Cellule–entière, on retire la pipette du milieu, induisant une rupture de la membrane de part et d’autre du patch,

-          Les bords libérés se ressoudent pour former une vésicule.

 

"  La surface extracellulaire est située dans le milieu externe.

Þ  Etude du rôle des substances et facteurs qui agissent sur le coté extracellulaire de la membrane sur le canal ionique.

 

 

 

 

 

 

 


Les travaux de Patch clamp se font sur des cultures de cellules isolées. Mais il existe de plus en plus des applications de technique de Patch clamp sur des systèmes plus intégrés, tels que des tranches de cerveau.

 

Le courant unitaire est caractérisé par des déflexions abruptes verticales, soit vers le haut, soit vers le bas.

 

Par convention :

Pour un courant cationique :

-          La déflexion est vers le haut quand le courant est sortant,

-          La déflexion est vers le bas quand le courant est entrant.

L’ouverture d’un canal unitaire va suivre des processus aléatoires. C’est–à–dire que l’ouverture d’un canal unitaire et son temps d’ouverture (dans des conditions données) sont indépendants de son état passé.

 

On ne peut connaître que la probabilité de changement d’état.

 

v Séparation des canaux ioniques :

Ø  Utilisation d’ions imperméants de certains canaux :

 

Exemples :

-          Cs substitué au K+ peut supprimer les courants K;

-          Co, Ni substitué au Ca2+ peut supprimer les courants Ca2+ ;

-          Nméthyl_D_glutamate substitué au Na+ peut supprimer les courants Na;

-          Méthylsulfurate substitué au Cl peut supprimer les courants Cl– ;

 

Ø  Utilisation d’inhibiteurs sélectifs des canaux :

 

Exemples :

-          Les canaux Na:   TTX, STX (saxitoxine) ;

-          Les canaux K:     TEA, Apamine, 4_AP, Quinine ;

-          Les canaux Ca2+ :  Vérapamil, Dihydroxypyrimidine (Niférine) ;

-          Les canaux Cl– :    DIDS, IAA–94, SITS.

 

Ø  Utilisation de protocoles de stimulation particuliers :

 

·         Le potentiel de maintien est placé à une valeur où un canal est fermé ou inactivé :

 


Dépolarisation de –80 à –5 mV

                                                      "  INA+  +  IK+

 

 

Dépolarisation de –40 à –5 mV

                                                                                    "  IK+

 

Différence des 2 courbes

                                                                  "  INA+

 

 

A –40 mV, les canaux Na+ sont déjà inactivés.

 

·         Séquences de pulse :

VTEST

 
Il existe différents protocoles :

VTEST

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


"  Cinétique de fermeture                                 "  Cinétique de fermeture et de réouverture

 

 

·         Temps de mesure :

 

Les canaux possèdent des temps cinétiques différents. On effectue des mesures après un temps donné suite à la stimulation.

 

·         Expression du canal dans une cellule :

 

On développe l’expression du canal cloné dans une cellule (exemple des ovocytes de xénope)

 

Exemple :  Récepteur canal NMDA :

 

Il s’agit d’un récepteur d’un neurotransmetteur excitateur : le glutamate. Il permet l’entrée du Ca2+

 

Ce récepteur fonctionne dans les processus physiologiques et cérébraux, dont la mémoire.

Il est responsable de nombreuses pathologies, comme l’accident cardiovasculaire :

-          Les vaisseaux sanguins bouchés déclenchent un mouvement de panique des récepteurs NMDA.

-          Ils créent une entrée massive de Ca2+ qui cause la mort du neurone.

 

On utilise la configuration Outside–out avec l’application de glutamate sur différents types de récepteurs NMDA :

 

Un assemblage de sous–unités NR1 et NR2A présente :

"  Un courant est de plus grande amplitude,

"  Un temps d’ouverture est plus long.

Qu’avec un assemblage de sous–unités NR1 et NR2C.

 

v Analyse des courants ioniques :

Ø  Amplitude du courant :

 

Après un grand nombre de la même expérience, on obtient l’histogramme d’amplitude représentant la fréquence d’apparition du courant en fonction de son amplitude.

 


Dépolarisation :

 

                   j

 

                   k

 

                   l

 

En général, on obtient une courbe Gaussienne (présentant un pic) Ce pic correspond à une valeur moyenne d’amplitude de courant.

 

Autre exemple :

 

                     Fermé             Ouvert

 

 

 

 

 

                                                                              Cette largeur est due au bruit de fond

 

 

 


                                                                       Courant en picoA

                          0                     1,5

 

Ø  Durée d’ouverture :

 

 

 

 

 


Exemple de canaux K(courant sortant) :

                                                                              +10 mV

          –45 mV

 

–70 mV

 

 

 

 

 

 

 

"  Plus on dépolarise, plus la probabilité d’ouverture augmente et plus l’amplitude augmente.

 

Courbe d’activation :

 

Forme sigmoïde

 

 

 

 

 

 

 

Ø  Potentiel d’inversion du courant EINV :

 

EINV est la valeur de potentiel à laquelle le courant change de sens.

A ce point, le courant est nul.

 


Dépolarisation :

 

 

 

 

 

 

 

Courbe du courant I en fonction du potentiel V :

                                            I

 

 

 

 

 

 


                                                                                         V

 

                                                             EINV

 

 

 

Canaux ioniques voltage–dépendants

 

Les canaux ioniques Na+, K+ et Ca2+ présentent une grande famille de protides.

-          Ils sont responsables de variations de potentiel membranaire, en particulier du PA.

-          Ils régulent un grand nombre de processus cellulaires.

 

Un grand nombre de ces canaux ioniques ont été isolés, purifiés, clonés ; mais il y a encore un travail de recherche immense sur leur fonctionnement.

 

 

v Structure :

 

Le canal est formé par plusieurs sous–unités avec une sous–unité principale a (ou a1) et une ou plusieurs sous–unités auxiliaires (ou secondaires)

 

La sous–unité a présente une grande homologie de structure entre les différents canaux.

 

Pour les canaux Na+ et Ca2+ :

La sous–unité a présente 4 domaines transmembranaires, chacun constitué de 6 segments transmembranaires (S1 à S6)

 

Pour les canaux K+ :

La sous–unité a est formée d’un seul domaine transmembranaire, constitué de 6 segments transmembranaires (S1 à S6)

 


La sous–unité a va former le pore sous–unité canal. Le changement de sa conformation détermine l’état du canal.

Elle contient également un élément qui détermine la sensibilité de ces canaux au potentiel, il s’agit plus spécifiquement du segment S4.

 

Le segment S4 contient une série d’acides aminés chargés positivement (lysine et arginine) responsable de la sensibilité au potentiel de ces canaux.

 

Lors d’une dépolarisation, ces charges positives sont attirées vers la surface externe de la membrane.

"  Le mouvement de charges produit le changement de conformation.

 

Les sous–unités auxiliaires sont de nombre et de structure différents. Elles ne sont pas bien connues : elles peuvent modifier la cinétique du canal (stabilité de la conformation active)

 

v Le canal K+ « de la rectification retardée » :

Ø  Canal unitaire :

 

Il est activé par la dépolarisation et participe à la repolarisation du PA.

                                         

Configuration Inside–out :                                   2,5 mM + TTX                       EK+ = –96 mV

                                                                                                           –5 mV

 


                                                                                         –100 mV

Plus l’amplitude de dépolarisation augmente :

-          Plus la probabilité d’ouverture augmente,

-          Plus l’intensité du courant augmente.

 

L’ouverture se fait toujours avec un délai par rapport au début de la dépolarisation.

 

Histogramme de latence (ou délai) d’ouverture :

Le délai est dû à plusieurs changements conformationnels avant d’atteindre l’état ouvert.

              Dépolarisation de –100 à +40 mV

 

                               Dépolarisation de –100 à –30 mV

 

Plus on dépolarise, plus le délai diminue.

 

 

 

 

Ø  Potentiel d’inversion :

 

Lors d’une variation du potentiel membranaire, on mesure le courant ionique dans les conditions de concentrations physiologiques.

 

                   – 60

 


  –100

 

                   – 20

 

  –100

 

                   0

 

  –100

 

                   + 20

 

  –100                                                                                          

 

"  Le courant est toujours sortant, il n’y a pas d’inversion du courant

Et à des valeurs plus négatives, il n’y a pas d’ouverture (PO nul)

 

Þ  On obtient le potentiel d’inversion EINV par extrapolation.

 


PO                                                                                  I

 

 

 

 

                                                       V                                                                               V

                                                                  – 90

S’il y a une modification des concentrations et que l’on se place dans des conditions isotoniques :       [K+]EXT = [K+]INT = 120 mM

 

                   – 60

 


  –100

                                                                                                                 "  EINV = 0  et  EK+ = 0

                   – 30

    Þ Le canal sélectif pour l’ion K+

  –100                                                                                                       (passage presque exclusif)

 


                   + 30

 

  –100

 

Ø  Courant global :

 

Une dépolarisation de membrane en courant imposé ou en patch clamp (configuration whole–cell) met en jeu plusieurs canaux et la somation de tous les canaux donne une courbe lisse. Cela fonctionne aussi avec un canal dans 100 expériences.

 

 

 

 

 


Plus la dépolarisation est longue, plus le nombre de canaux ouverts est important.

 


Courbe I = f(V) :

 

 

 

 

 

C’est la combinaison des 2 courbes :

 


La courbe d’activation :                                                    La courbe du gradient électrochimique :


 

 

 

 

 

 

 

 


Quand tous les canaux sont ouverts, c’est la force électrochimique qui dirige le passage ionique.

 

Ø  Pharmacologie :

 

-          TEA :

Il s’agit du 1er composé chimique utilisé pour bloquer les canaux K+ dans les préparations de l’axone de calmar.

Mais il ne bloque pas spécifiquement les canaux K+ à rectification retardée : il bloque aussi d’autres canaux K+.

 

 


                                                                  (Courant unitaire)

 

 

"  L’action du TEA est dose–dépendante.

-          Cg :

C’est un analogue du TEA.

Soit une expérience : Cg  (+ TTX pour bloquer les canaux Na+) appliqué au niveau intracellulaire.

 

 

 


                                                                         + TTX                                         + TTX + Cg

 

 

 

Il y a un effet retardé de Cg.

En fait, le Cg se fixe sur le canal ouvert pour annuler le courant.

 

Il existe d’autres inhibiteurs avec des spécificités différentes aux différents types de canaux K+.

 

v Le canal Na+ :

 

C’est canal voltage–dépendant (= son activation se fait dépolarisation)

Il est responsable de la genèse du PA (phase ascendante)

 

Ø  Inactivation :

Configuration Inside–Out

 

 


                                                                              Courant entrant

 

"  Cette inactivation est caractéristique du canal Na+.

 

Il se présente sous au moins 3 états :

 


 

C                                   O                                            I


 

 

 

 


= Etat imperméable mais non fermé

L’inactivation peut être affectée par la protéase (comme la pronase) qui diminue, voire inhibe, l’état inactivé du canal.

                   0

                                                                                                     + Pronase (intracellulaire)

–80

 

 

"  La suppression de l’inactivation se fait par clivage peptidique.

 

Hypothèse :

L’inactivation résulte d’un blocage du port ionique par une séquence intracellulaire de la protéine canal, blocage qui ne se produit qu’après ouverture.

Cette hypothèse est par la suite confirmée par les travaux réalisés sur le canal K+ « shaker B » qui présente aussi cette inactivation.

"  La zone N–terminale est responsable de l’inactivation du canal Na+.

On parle de l’inactivation de type N.

 

La zone N–terminale est séparée en 2 domaines :

-          Les 20 premiers acides aminés qui correspondent à la balle responsable directement du blocage du pore,

-          Plusieurs dizaines d’acides aminés qui forment à la chaîne, c’est le site de clivage par la clypsine.

 


Ø  Potentiel d’inversion :

 

"  EINV = +50 mV

 

Il s’écarte un peu du ENa+ (= 58 mV)

Dans ces conditions, le canal Na+ laisse passer d’autres ions que le Na+ comme K+ (étude de perméabilité relative) mais reste majoritairement perméable au Na+.

 

Ø  Courant global :

 

Soit une préparation de l’axone géant de Calmar en potentiel imposé, en présence de TEA pour bloquer les canaux K+ de la rectification retardée.

 

 

 

 

 


                                                                                                     +  Pronase

 

Courbe d’activation :                                                 Courbe I = f(V) :

                                                                                                                 (µA)

 

 


                                                                                              –50   –30                             50

 

 

 

 

La courbe I = f(V) est la combinaison de la courbe de probabilité d’ouverture PO et du gradient électrochimique.

Le bas de la courbe est responsable du processus régénératif du PA.

 

Processus régénératif :

 

Une dépolarisation membranaire

ß

Ouverture de canaux Na+

ß

Entrée de Na+

ß

Augmentation de l’amplitude de dépolarisation

ß

Ouverture de canaux Na+

ß

Etc. jusqu’à atteindre un seuil déclenchant d’un PA

 

Ø  Pharmacologie :

 

La TTX (tétrodotoxine) et la STX (saxitotoxine) ont des propriétés d’inhibition du courant Na+. Ce sont les 1ers utilisés pour étudier le PA. Ils agissent au niveau du pore.

 

Il existe d’autres toxines qui peuvent affecter le courant Na+. Le canal présente au moins 4 sites de liaison pour ces toxines.

 

§  1ère famille :

 

Ce sont les alcaloïdes, des extraits de différentes espèces de plantes, comme l’aconitum, le vératrum. Ces plantes sont connues comme étant de puissants poisons.

 

La caractéristique des alcaloïdes est leur solubilité dans les lipides.

 

Cette famille induit un déplacement de la courbe d’activation vers des potentiels plus négatifs et ralentit le processus d’inactivation.

 

"  Elle entraîne une activité rythmique répétitive du PA.

 

Exemple :

La vératridine est une toxine qui agit sur le côté intramembranaire (lipophile) du canal Na+.

"  Le courant ionique dure plus longtemps (de l’ordre des secondes au lieu de ms) sans application de dépolarisation.

 

Elle entraîne l’ouverture de canaux Na+ générant ainsi un PA (exemple des crises d’épilepsie)

De plus, elle entraîne une diminution de l’inactivation.

 

"  Le PA dure donc plus longtemps.

 

§  2ème famille :

 

On y retrouve des toxines de scorpion et d’anémone de mer, elles sont appelées a–toxines.

 

Elles entraînent le ralentissement, voire le blocage, de l’inactivation et donc le prolongement du PA. Elles agissent sur la face extracellulaire de la sous–unité a (entre les segments S5 et S6)

 

§  3ème famille :

 

Il s’agit de la famille des b–toxines extraites à partir de venin de scorpion.

 

Leur caractéristique est la réduction du seuil d’activation du canal sans modifier l’inactivation. Leur action se fait sur la partie extracellulaire : un site différent des a–toxines.

 

"  Il y a une ouverture du canal lors d’un potentiel de repos.

 

§  4ème famille :

 

C’est la famille des brévétoxines.

Elles déplacent la courbe d’activation et bloque complètement l’inactivation par une action membranaire.

 

Leur utilisation sert à l’isolation des différents canaux Na+ (± sensibles aux différentes toxines) Elles servent de sonde moléculaire.

 

v Le potentiel d’action :

 

Il présente 2 périodes réfractaires :

-       Une période absolue  =     Tous les canaux Na+ inactifs, il n’y pas d’autre PA déclenché ;

-       Une période relative  =     La probabilité que les canaux Na+ se referment est encore petite, il est difficile pour refaire un PA.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

La phase de repolarisation :

-          dure plus longtemps avec d’ajout de pronase (canaux Na+),

-          dure encore plus longtemps avec l’ajout de TEA (canaux K+),

-          est complètement bloquée quand ces 2 substances sont couplées.

"  La phase de repolarisation met en jeu l’inactivation des canaux Na+ et K+.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Exception :

 

Certains PA mettent en jeu une entrée Ca2+ via des canaux Ca2+ voltage–dépendant.

 

v Le Canal Ca2+ :

 

En absence de Na+ et l’ajout de TTX, on observe la génération d’un PA à plateau calcique.

 

 

 

 

 


Ce PA dure plus longtemps.

 

 

Il est dû à un flux de Ca2+ à travers des canaux spécifiques au Ca2+. Leur conformation dépend du potentiel membranaire (ils sont voltage–dépendant)

 

Une dépolarisation induit l’ouverture de ces canaux et donc une entrée massive du Ca2+.

 

 

Le PA à plateau calcique (observé dans les neurones et les fibres musculaires du cœur) peut être dû :

-          Soit uniquement par une entrée de Ca2+   "  Plateau calcique pur ;

-          Soit par une entrée de Ca2+ accompagnée par l’ouverture de canaux Na+ "  Ouverture plus importante ;

 

La repolarisation est liée à l’activation de canaux K+ dépendant du Ca2+.

 

Il existe 2 familles de canaux Ca2+ voltage–dépendants :

-          Les canaux calciques de type L,

-          Les canaux calciques de type T.

 


Les canaux calciques de type L :

Ils ont un seuil d’activation bas (» –70 mV) et présentent une inactivation.

Ils sont appelés LVA = Low Voltage Activated.

 

Les canaux calciques de type T :

Ils ont un seuil d’activation haut. Ils sont appelés HVA = High Voltage Activated.


Les HVA ont un rôle important dans les phénomènes du système nerveux. Leur trop grande activation peut aboutir à la mort du neurone (conditions pathologiques)

 

L’étude des canaux Ca2+ est contrecarrée par des problèmes expérimentaux :

-          Il n’existe pas de préparation riche en canaux Ca2+ voltage–dépendants.

-          De plus, les canaux Ca2+ présentent des caractéristiques physiques particulières telles qu’une inactivation Ca2+–dépendante, la perte d’activité sur un fragment de membrane isolée.

Ces caractéristiques doivent être considérées pour l’étude de ces canaux.

 

Au niveau cérébral, il existe un gradient de concentration très fort :

-          [Ca2+]INT = 10–7 M

-          [Ca2+]EXT = 10–3 M

Ceci porte la valeur du ECa2+ à des valeurs très positives :                        ECa2+ » + 116 mV

 

Le gradient électrochimique est en faveur d’une entrée de Ca2+ et localement la concentration en Ca2+ est susceptible de varier de façon très importante. Or l’augmentation de la concentration interne en Ca2+ peut être à l’origine de plusieurs phénomènes.

 

Exemple :

-          L’activation des canaux K+ dépend à la concentration interne en Ca2+.

-          L’inactivation des canaux Ca2+ dépend à eux–même.

-          L’activation d’un grand nombre de protéines, dont des enzymes (comme la phosphatase, la kinase, etc.)

Tous ces phénomènes sont impliqués dans l’activité physiologique du neurone (libération du neurotransmetteur, l’expression des gènes)

 

Il est donc nécessaire que la concentration interne en Ca2+ soit très finement régulée de manière que le taux de Ca2+ intracellulaire soit maintenu à des valeurs très basses.

Pour cela, il existe des mécanismes de régulation (pompes ATP–dépendantes, réticulum endoplasmique, protéines fixant le Ca2+)

Expérimentalement, pour maintenir la concentration intracellulaire en Ca2+ à des valeurs fixes, on introduit un tampon calcique du type EGTA ou BAPTA (= chélateurs de Ca2+)

 

Ø  Caractéristiques des canaux Ca2+ :

 

-          Phénomène de « Run down » (= disparition) :

Certains canaux Ca2+ voltage–dépendant perdent leur activité quand on travaille sur un patch isolé.

 

 

 

 

 


+ Protéine Kinase A

 

                                                           0                                              0

      

                                              –40                                         –40

                   0

 

–40

 

 

Conclusion :

Le passage de la configuration Cellule–attachée à la configuration Inside–Out a causé la perte de certains éléments dont dépendent les canaux Ca2+.

 

Ces canaux sont donc dépendants de leur état de leur état de phosphorylation (PKA)

"  Il faut que le canal soit phosphorylé pour être activable.

 

En réalité, c’est un peu plus compliqué…

Il peut y avoir un 2ème mécanisme :

On peut ajouter de la leupeptine pour inhiber

l’irréversibilité du phénomène de run down

 

Le Fura2 est une sonde fluorescente dont l’intensité dépend du Ca2+.

Le Barium est un équivalent du Ca2+ (même perméabilité)

"  Certains canaux Ca2+ vont être inactivé par le Ca2+ lui–même :

(configuration Whole–cell)

                   0

 


–40

                               Ca2+                                        Ca2+

 

                                          Ba2+                                             Ca2+ + chélateurs

 

Avec juste du Ca2+, il y a une diminution de l’amplitude du courant entrant :

"  Régulation pour éviter une entrée massive qui peut être délétère pour la cellule.

 

Schéma :

      

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                                              Ca2+                            Calcineurine

                                                                                         & [Ca2+]          (= déphosphatase)

 

Ø  Canaux Ca2+ à haut seuil d’activation :

 

Ils forment une famille hétérogène de canaux voltage–dépendant. Ils ont un rôle important dans la libération de neurotransmetteur (avec le PA)

 

Ils sont mis en jeu dans certains PA          (caractéristique majeure : haut seuil)

Ils ont des activation et inactivation lentes.

 

 

 

 

 

 

 

 

                       

Ellipse: 2Ellipse: 2                        0

Ellipse: 3Ellipse: 3Ellipse: 1Ellipse: 1         –80

 

 

Le courant de queue est une augmentation du courant au moment de la repolarisation.

 

Explication de ce courant :

"  Le courant est la conjugaison de la perméabilité du canal et du gradient électrochimique :

 

j  Le gradient électrochimique est important :  Vm – ECa2+ = –80 – 116 = –196 mV

 Mais les canaux sont fermés.

k  Le gradient électrochimique est moindre :  Vm – ECa2+ = 0 – 116 = –116 mV

 Mais les canaux sont ouverts, il y a donc un courant.

l  Le gradient électrochimique est important :  Vm – ECa2+ = 0 – 116 = –196 mV

 Et les canaux sont ouverts, il y a donc un fort courant.

 

Ce courant de queue est aussi observé dans certains canaux K+.

 

Courbe I = f(V) :                                         (µA)

 


                                                                                          » 70

 

 

EINV  » +70 mV

ECa2+ = +116 mV

 

"  Il y a une non sélectivité du canal par rapport à l’ion Ca2+.

Le rapport de perméabilité du Ca2+/K+ = 6000

 

Il y a une multiplicité des canaux Ca2+ à haut seuil d’activation :

" Il existe des canaux de type : L, N, O, P, Q, R (et plus s’il y a une autre découverte)

 

Ces différents canaux sont plus ou moins sensibles à des inhibiteurs pharmacologiques.

 

Exemple :

-          Les canaux de type L sont sensibles à la nitreudipine et à la dihydropyrimidine (un médicament utilisé pour les problèmes cardiaques  et de vascularisation)

-          Les canaux de type N sont bloqués de façon plus spécifique par la w_conotoxine_GVTIA.

-          Les canaux de type P sont bloqués par la FTX et la w_aga_IVA.

 

 

Les canaux N ont un rôle dans la libération de neurotransmetteur, et sont synthétisés dans plusieurs structures du SNC.

Les canaux P sont synthétisés presque exclusivement dans les cellules de Purkinje (soit » 92% des canaux Ca2+)

Les proportions des différents types de canaux à haut seuil dépend du type cellulaire et de la région étudiée.

                                          + Nitreudipine

      

                   2

                                                 Canaux   

      de type L     + w_conotoxine

                   1

                                                                  Canaux de type N

 

 

 

Les gènes codant pour la sous–unité a1 des canaux Ca2+ ont été clonés, d’abord à partir du muscle squelettique, puis à partir de divers tissus dont le cerveau.

 

Les 5 sous–unités a1 sont codées par 5 gènes différents qui ont été identifiés : les gènes A, B, C, D et S.

-          Les sous–unités C, D et S correspondent à des canaux de type L,

-          La sous–unité B correspond à des canaux de type N,

-          La sous–unité A correspond à des canaux de type P.

 

Il existe plusieurs variants pour chaque sous–unité a1 selon le phénomène d’épissage alternatif.

Exemple :  La sous–unité a1D présente 4 variants.

 

Il existe des sous–unités auxiliaires a2, b, g, etc. donc le rôle n’est pas trop connu.

 

Par contre, on sait que la sous–unité b est une sous–unité cytoplasmique qui module l’activité du canal.

La présence de cette sous–unité fait augmenter considérablement l’amplitude du courant de Ca2+ et fait diminuer le seuil d’ouverture.

                                                I

                                                         10     20                               V

 


                                                                                                     a1

 

                                                                              a1+b

 

 

 

Ø  Canaux Ca2+ à bas seuil d’activation :

 

L’existence de ces canaux, appelés LVA, a été suggérée, il y a plus de 20 ans, pour expliquer l’activité rythmique déclenchée dans les neurones thalamiques à la suite de leur hyperpolarisation.

Cette activité, un peu paradoxale de part son activation par hyperpolarisation, semblait s’expliquer par l’existence de canaux Ca2+.

Ces dernier sont partiellement inactivés dans la gamme du potentiel de repos, mais leur l’activation est à nouveau permise par l’hyperpolarisation de ces neurones.

 

L’avènement de la technique de Patch Clamp a permis une description électrophysiologique de ces canaux.

 

En fait, au niveau du thalamus, l’étude des canaux a permis de confirmer l’implication de canaux de type T dans :

-          la genèse de l’activité rythmique des neurones,

-          l’activité cardiaque,

-          la sécrétion hormonale des neurones hypothalamiques,

-          l’épilepsie.

 

Inactivation des canaux à bas seuil :

 

Etude de neurones sensoriels dans la conformation de whole–cell :

 

                                                                  VTEST = –35

 

 

 

 

       VH =

Le canal est déjà inactivé.

 

 

 

Pour avoir une réactivation,

il faut atteindre une nouvelle hyperpolarisation.

 
                – 55 :

                – 65 :

                – 75 :

                – 85 :

                – 95 :

 

              – 105 :

 

 

Courbe d’inactivation :

                                                                  I/IMES

                                                                    1

 

 

                                                                  0,5

                              

                              

                                                                                                                    VH

                                                                                      –80             –40

Il existe une diversité de canaux :

On connaît 3 gènes différents pour a1         "  3 isoformes de a1.

       De plus, pour chaque sous–unité, il y a différents variants.

 

Ø  Localisation et rôle spécifiques des canaux Ca2+ :

 

Les HVA et les LVA peuvent coexister au niveau d’une même cellule.

 

Etude sur un neurone sensoriel :

Les canaux Na+ et K+ sont bloqués.

                                              I (mA)

                       –50          –10                                       V

                                             0

Zone de Texte: à V = –10 mV, c’est le seuil d’activation des HVA 
et le seuil d’inactivation des LVA.
 

 


                                                –1

 

 

                                          –2

 

 

 

Etude sur la synapse géante de calmar :

Les canaux Na+ et K+ sont bloqués.

                       Courant pré–synaptique

 

                                                      Courant post–synaptique

 

                            ICa2+

 

ICa2+ est normalement vers le bas (courant entrant) Ici, il est indiqué vers le haut pour faciliter la lecture de la courbe.

 

 

L’entrée massive de Ca2+ au niveau pré–synaptique est responsable de la libération de neurotransmetteur (due au gradient électrochimique)

 

 

Plus le PA est bref, plus les canaux Ca2+ HVA (= de type T) sont impliqués dans le courant global.

  Û

Plus le PA est long, plus l’implication des canaux Ca2+ LVA est proportionnellement importante.

 

 

                   [Ca2+]INT

 

 

 

 

 

 

 

 

 


                                                                                                       Temps du PA