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Introduction générale

aux régulations des voies métaboliques

 

v Nécessité d’un contrôle des voies métaboliques :

 

Une voie métabolique est une réaction en chaîne : le produit d’une réaction devient le substrat d’une suivante. Il faut donc un contrôle fin.

De plus, les voies métaboliques cellulaires sont interconnectées : elles doivent fonctionner de façon coordonnée.

 

Pour y parvenir, il y a la mise en place de :

-          Régulations internes à chaque voie,

-          Régulations entre les voies métaboliques,

-          Régulations dépendantes de l’état physiologique de l’organisme.

 

Mais il est inutile de contrôler toutes les activités enzymatiques. La régulation la plus importante à contrôler est la réaction la plus lente ; ainsi on contrôle le débit métabolique.

 

Ce contrôle s’effectue donc sur des enzymes clés, appelées enzymes allostériques, qui se situent souvent après un carrefour métabolique.

" Ces enzymes clés catalysent des réactions irréversibles.

 

L’adaptabilité des voies métaboliques se fait grâce à un certain nombre de mécanismes régulateurs (à court et à long terme)

 

v Les différents niveaux de régulation :

.Poly p 1.

Ø  Perméabilité membranaire :

§  Transport passif à travers une membrane :

 

Il se fait en fonction du gradient de concentration et ne nécessite pas de protéines de transport.

                        Flux

(Vitesse de passage                                                            Semi perméable

par unité de surface)

Le transport passif est insaturable.

 

 

                                                                                         Gradient de concentration

 

Exemple de molécules utilisant ce transport : les stéroïdes.

 

 

§  Transport facilité (ou exergonique) :

 

Il se fait toujours en fonction du gradient de concentration et mais nécessite un transporteur pour facilité le transport.

                        Flux

(Vitesse de passage                                                            Semi perméable

par unité de surface)

 

 

                                                                                         Gradient de concentration

 

Le transport facilité est saturable. Les protéines transporteurs se comportent comme des enzymes : les sites de fixation peuvent tous être saturés.

 

Exemple d’éléments utilisant ce transport : les ions, nucléotides, acides aminés et métabolites.

 

ê Attention !

Ne pas confondre avec le transport actif. Ce dernier est un transport qui se fait contre le gradient de concentration ; c’est donc un processus endergonique.

 

Les différents types de transport facilités :

 

Leur classification se fait selon la stoechiométrie du processus :

-          Uniport,

-          Symport,

-          Antiport.

 

Ø  Disponibilité en substrat et coenzymes :

 

Il s’agit d’une régulation indirecte qui permet la disponibilité des éléments de la réaction.

 

Ø  Régulateurs exogènes du métabolisme cellulaire :

 

Les agents sont :

-          Les hormones (présentes dans la circulation),

-          Les facteurs de croissance (action locale, produits par les cellules proches),

-          Les cytokinines (dans le processus anti–inflammatoire, même mécanisme que les facteurs de croissance),

-          Les médiateurs nerveux.

 

§  Les régulateurs hormonaux de l’homéostasie glucidique :

 

-          Insuline, sécrétée par les cellules b des îlots de Langerhans pancréatiques ;

-          IGF–I, glucocorticoïde sécrété par le cortex surrénalien (= couche externe de la glande surrénale) ;

-          Glucagon, sécrété par les cellules a des îlots de Langerhans pancréatiques ;

-          Adrénaline (ou épinéphrine), catécholamine sécrétée par la médulla surrénalienne (= partie intérieure de la glande surrénale) ;

Catécholamine =     Adrénaline (ou épinéphrine)     &   Noradrénaline (ou norépinéphrine)

-          Hormone de croissance (GH), sécrétée par l’hypophyse antérieure, rôle important dans la mobilisation des voies du métabolisme glucidique.

 

§  Régulation hormonale de la glycémie :

 

Hormone

Action

Insuline

( Glucose

Hormone hypoglycémiante

Glucocorticoïdes

& Glucose

Hormones

hyperglycémiantes

Glucagon

& Glucose

Hormone de croissance

& Glucose

Adrénaline

& Glucose

 

Les cibles tissulaires principales :  le foie, les muscles squelettiques et le tissu adipeux.

 

La sensibilité de la cellule aux agents de régulation est fonction de sa disponibilité en récepteurs à ceux–ci.

 

§  Transmission de l’information de l’extérieur vers l’intérieur de la cellule :

 

Hormone

 


                                                                  Récepteur

 

 

                                                        Transducteur (par exemple : protéine G)

 

                                                      Effecteur (par exemple : Adénylate cyclase)

                   ATP                                       " Activité enzymatique

                                          Messager secondaire

                                          ou 2nd messager          (exemple : AMPc)

 


Apport des informations dans la cellule    par Activation–Stimulation de :

 

                                          Protéine kinase A  (activée)

                                                      $

                                          Phosphorylation de protéines

                                                      $

                                          Modification d’activité

                                                      $

                                          Effets biologiques

 

La transduction du signal hormonal à travers la membrane plasmique induit une cascade d’évènements intracellulaires qui servent à amplifier le signal et à le distribuer aux différents compartiments cellulaires pour modifier plusieurs fonctions cellulaires en parallèle.

.Poly p 1.

 

Les hormones induisent des réponses cellulaires lentes et rapides.

.Poly p 1.

 

·         Voie de signalisation de l’adrénaline :

.Poly p 2.

Fixation de l’hormone sur le récepteur

$

Changement conformationnel

$

Communication de ce changement à la protéine G

= hétéro–trimère à activité ATPasique

$

Perte de conformation

$

Activation de l’adrénylate cyclase

$

Synthèse en grande quantité d’AMPc à partir de l’ATP

$

Activation de la protéine kinase A par l’AMPc

+

Hydrolyse de la partie GTP de la sous–unité a par les propriétés intrinsèques de celle–ci

" Verrou de sécurité évitant une situation permanente

 

Activation de la protéine kinase A par l’AMPc :

.Poly p 2.

                                                                  Sous–unité régulatrice

 

                                                                                                            Sous–unité catalytique

 


Séquence

« Pseudo–substrat »

 

 

                                                                                                                             AMPc

 

Fixation de l’AMPc

$

Changement conformationnel

au niveau du la séquence « Pseudo–substrat »

$

Libération de la sous–unité catalytique

 

 

 

 

 

 


" Phosphorylation de protéines sur la séquence peptique :

Arg – Arg – quelconque – Ser ou Thr

La phosphorylation se fait sur le dernier acide aminé de cette séquence (Ser ou Thr).

"  Cette protéine kinase A est donc appelée Ser_Thr kinase.

 

Au final, la sous–unité catalytique est libérée.

 

 

·         Voie de signalisation de l’insuline :

 

Il y a une réponse dimérisée reliée par un pont disulfure :

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


ß

Activité de la Tyrosine kinase

ß

Phosphorylation de la Sérine

Et

Cascade de déphosphorylation

ß

Activités phosphoasique et kinasique altérées

ß

Effets biologiques terminaux :

-          Synthèse de glucose, de protéines, lipides, glycogène ;

-          Croissance et transport ;

-          Synthèse de l’expression des gènes.

 

 

·         Les stéroïdes :

 

Il n’existe que des récepteurs intracellulaires.

Une fois que l’hormone est fixée, il intègre le noyau de la cellule et active un certain nombre d’expressions de gènes (transcription)

 

 

 

Ø  Régulation du nombre de molécules enzymatique actives :

 

Transcription                      Traduction                    Régulation post–synaptique

 

ADN               ARN               Enzyme

                        (épissage alternatif  "  Isoenzymes)

 

                                                                                         Dégradation

 

 

 

·        Régulation par phosphorylation–déphosphorylation,

·        Transition allostérique,

"  Les plus importantes.

·        Activation par protéolyse limitée

"  Suppression du précurseur protéique,

·        Régulation par combinaison des sous–unités.

 

 

§  Contrôle transcriptionnel :

 

Le contrôle se fait sur la vitesse de la transcription et sur la stabilité de l’ARN.

 

·         Isoenzymes :

 

Elles diffèrent dans leurs séquences peptidiques mais catalysent la même réaction.

Elles possèdent des cinétiques enzymatiques différentes et/ou ont des affinités différentes vis–à–vis du substrat et/ou sont régulées de manières différentes.

 

L’utilisation différentielle de ces isoenzymes permet une régulation fine du métabolisme adaptée à chaque organe ou tissu cellulaire.

 

Exemple : la lactate déshydrogénase :

C’est une protéine tétramérique possédant 2 types de sous–unités (avec 75% d’homologie) :  une appelée H (Heart) et une autre appelée M (Muscle)

 

Il existe différentes combinaisons possibles :         H4 ; H3M ; H2M2 ; HM3 ; M4

                                                                          (cœur)                                 (foie)

 

-          H4 a une forte affinité pour le pyruvate et est inhibée allostériquement par des concentrations élevées de pyruvate.

"  Dans le cœur, la glycolyse est importante, donc H4 n’est quasiment pas active.

 

-          M4 a une faible affinité pour le pyruvate mais elle n’est pas inhibée.

"  La sous–unité M prédomine dans les tissus supportant les conditions anaérobies (muscle, foie) alors que la sous–unité H prédomine dans les tissus aérobies.

 

Intérêt des isoenzymes :

 

-          Obtenir des profils métaboliques différents des différents organes.

Exemple :         Les 2 isoformes de la phosphorylase du glycogène présentes dans les muscles et le foie possèdent des régulateurs différents.

 

-          Assurer des localisations subcellulaires différentes et donc des rôles métaboliques différents dans la cellule.

Exemple :         L’isocitrate déshydrogénase.

 

-          Adapter les activités enzymatiques aux différentes étapes du développement.

Exemple :         Les tissus embryonnaires et fœtaux sont différents des tissus adultes ;

                        Les cellules cancéreuses sont différentes des cellules normales.

 

-          Assurer des réponses différentes (suivant les organes) aux effecteurs allostériques :

Exemple :         La glucokinase hépatique et les hexokinases extra–hépatiques ont des sensibilités différentes à l’inhibition par le glucose_6è.

 

 

§  Contrôle traductionnel :

 

Il se fait sur la vitesse de traduction et sur la ½ vie de la protéine.

 

§  Contrôle post–traductionnel :

·         Régulation allostérique :

 

Exemple d’enzyme allostérique : L’aspartate transcarboxylase (ATCase) :

 

Elle catalyse la 1ère étape de la voie de synthèse des bases pyrimidiques :

 

Carbamoylè  +  Aspartate               N_Carbamoylaspartate                      Cytidine_Triè

 

 

Sa cinétique est non mickaellienne : la courbe a une allure sigmoïdale (et non hyperbolique)

 

Taux de formation

de N_Carbamoylaspartate

 

 

 

 

 

 

[ Aspartate ] en mM

                                                            10              20              30             40

 

Cette cinétique est due à la structure polymérique :         6 sous–unités catalytiques

                                                                                      +  6 sous–unités régulatrices

 

L’ATCase oscille entre 2 états conformationnels :

-          Un état R (relâché) possédant une forte affinité pour le substrat  (Km faible),

-          Un état T (tendu) possédant une faible affinité pour le substrat  (Km élevé)

L’état R présente une dilatation de la conformation permettant un meilleur accès pour les sites de réaction.

 

Le passage d’un état conformationnel à l’autre s’appelle la transition allostérique.

 

Il existe 2 modèles de transition allostérique :

-          Un modèle dit concerté, dans lequel la liaison de l’effecteur allostérique modifie la conformation de toutes les sous–unités (c’est le cas de l’ATCase),

-          Un modèle dit séquentiel, pour lequel il existe des états intermédiaires où certaines sous–unités sont sous la forme R et d’autres sous la forme T.

 

Taux de formation                                                                                     Etat R

de N_Carbamoylaspartate                                    si toutes les enzymes restaient dans l’état R

 

                                                                  Courbe réelle

 

                                                                                                     Etat T

si toutes les enzymes restaient dans l’état T

 

[ Aspartate ]

                                                            10              20              30             40

La courbe sigmoïde typique de l’enzyme allostérique est une combinaison des courbes de l’enzyme à l’état R (forte affinité pour le substrat) et de l’enzyme à l’état T (faible affinité pour le substrat)

 

Régulation allostérique de l’activité enzymatique (modèle concerté) :

 


                                                                  Inhibiteur

 

                                                                                                     Forme R  (état catalytique)

                                                                              Substrat                         Affinité plus  importante

   pour les activateurs

 

 


Activateur                               Equilibre tenu par

   les concentrations

       des effecteurs

activateurs et inhibiteurs

 

 

                                                                                                     Forme T   (état inhibé)

                                                                                                                 Affinité plus  importante

                                                                                                                     pour les inhibiteurs

 

 

L’effecteur allostérique peut–être :

-          Homotrope : il modifie sa propre affinité vis–à–vis de l’enzyme. C’est le cas du substrat.

-          Hétérotrophe : il modifie l’affinité d’une autre molécule, en général le substrat, vis–à–vis de l’enzyme.

 

-          Si l’effecteur déplace l’équilibre conformationnel de l’enzyme vers la forme R, il est dit activateur.

 

-          Si l’effecteur déplace l’équilibre conformationnel de l’enzyme vers la forme T, il est dit inhibiteur.

 

Pour l’ATCase :

-          L’aspartate (substrat) est un activateur allostérique homotrope,

-          L’ATP est un activateur allostérique hétérotrope,

-          Le CTP est un inhibiteur allostérique hétérotrope.

 

 

Taux de formation                        + 2mM            d’ATP                                                  Etat R

de N_Carbamoylaspartate                                   

 

                                                                  Courbe réelle

( Km ;  & affinité

( Km ; & affinité                                                                              Etat T

+ 0,4 mM CTP

 

[ Aspartate ]

                                                            10              20              30             40

 

Intérêt biologique de la régulation allostérique de l’ATCase :

 

-          Rétro–inhibition du CTP sur l’ATCase :

Elle permet de freiner la synthèse des bases pyrimidiques et d’éviter une accumulation de ces bases quand les conditions propices à la production d’ARNM et à la duplication de l’ADN sont absentes (par exemple : ATP faible)

 

-          L’activation par l’ATP :

L’ATP, par ce mécanisme, va promouvoir la production de l’ADN quand l’énergie et les bases puriques sont présentes en abondance.

 

 

Système K :            Affinité de l’enzyme pour R > T

 

Il suppose que le substrat a plus d’affinité apparente pour l’une des formes (R) que l’autre (T) :           "  La constante de Mickaelis de R est inférieure à celle de T.

       " Des sites de T peuvent aussi fixer le substrat et la KCAT avec laquelle ils se le transforment est la même que celle des sites R.

 

-          Le substrat se comporte comme un effecteur homotrophique ;

-          La saturation de l’enzyme par le substrat n’est pas mickaelienne ;

-          La fixation du substrat par l’enzyme est mickaelienne.

 

Vitesse        Avec activateur    Sans effecteur    Avec inhibiteur

Vm     

 

 

 

 

 

 

[ Aspartate ]

 

 

Système V :            Même affinité apparente de l’enzyme pour R et T par rapport au substrat mais KCAT de R > KCAT de T

 

Il suppose que le substrat a la même affinité apparente pour les formes R et T ; mais celles–ci sont différentes par leur KCAT .

 

-          La forme R a la KCAT la plus élevée ;

-          Le substrat ne se comporte pas comme un effecteur allostérique ;

-          La saturation de l’enzyme par le substrat est mickaelienne ;

-          Par contre, les fixations coopératives des activateurs et inhibiteurs allostériques ne sont pas mickaelienne.

 

·         Régulation par modification covalente :

 

La liaison d’une molécule à une enzyme peut modifier son activité.

-          La plus part de ces modifications sont réversibles (phosphorylation, acétylation)

-          D’autres sont irréversibles (modifications lipidiques permettant la localisation de l’enzyme à la membrane.

 

¨      Régulation par phosphorylation – déphosphorylation :

 

L’action de nombreuses protéines est modifiée par phosphorylation (= addition d’un groupement phosphoryle sur la fonction hydroxyle des résidus Sérine, Thréonine ou Tyrosine.

 

Les phosphorylations sont catalysées par des protéines kinases, elles–mêmes soumises à régulations.

 

Dans les conditions physiologiques, les réactions de phosphorylation sont irréversibles. L’existence de phosphatases, elles aussi régulées, assure les réactions de déphosphorylation.

 

" Le niveau de phosphorylation dépend donc des activités relatives des kinases et des phosphatases.

 

¨      Spécificité des kinases :

 

   Résidu Sérine

                                                O            H    O

 ││                      ││

Protéine non phosphorylée                           C — N — C — C — N

                                   

                                                                          H    CH2OH  H

 

 


                                                                  ATP                            Pi

                                                      Kinase                                       Phosphatase

                                                                  ADP                           H2O

 

 

                                                O            H    O

 ││                      ││

                                                                        C — N — C — C — N

                                   

                                                                          H   CH2Oè  H

 

 

 

 

   Résidu Tyrosine

                                                O            H    O

 ││                      ││

Protéine non phosphorylée                           C — N — C — C — N

                                   

                                                                          H    CH2        H

            

                                                                             

            

                                                                                OH

 

 


                                                                  ATP                            Pi

                                                      Kinase                                       Phosphatase

                                                                  ADP                           H2O

 

 

                                                O            H    O

 ││                      ││

                                                                        C — N — C — C — N

                                   

                                                                          H    CH2        H

            

                                                                             

            

                                                                                O–è 

 

Certaines protéines kinases sont multifonctionnelles et peuvent phosphoryler différentes protéines cibles. D’autres ne peuvent phosphoryler qu’une protéine particulière ou une famille de protéines structurellement proches.

 

Par exemple : La PKA ne phosphoryle que les séquence :

-          Arg – Arg – (petit acide aminé comme Gly) – Ser – (acide aminé hydrophobe de grande taille)

-          Arg – Arg – (petit acide aminé comme Gly) – Thr – (acide aminé hydrophobe de grande taille)

 

 

¨      Sérine – Thréonine protéines phosphatase :

 

-          Phosphatases de type 1 (PP1) :

 

Elles sont inhibées par 2 protéines cytosoliques thermostables ( I–1 et I–2)

Elles déphosphorylent préférentiellement la sous–unité b de la phosphorylase kinase.

 

-          Phosphatases de type 2 (PP2) :

 

Elles sont insensibles aux 2 protéines cytosoliques thermostables ( I–1 et I–2)

Elles déphosphorylent préférentiellement la sous–unité a de la phosphorylase kinase.

 

Elles ont été subdivisées selon leurs différences dans les mécanismes d’activation :

-          PP2–A (spontanément actives),

-          PP2–B (dépendantes du Ca2+),

-          PP2–C (dépendantes du Mg2+),

 

¨      Comment la phosphorylation modifie–t–elle l’activité enzymatique ?

 

-          Par l’addition de charges négatives, modifiant les interactions électrostatiques ;

-          Par formation de liaisons H, pouvant altérer les capacités de liaison de la protéine ;

-          En se comportant comme un effecteur allostérique, déplaçant l’équilibre entre les formes T et R de l’enzyme.

 

Intérêt biologique d’une telle régulation :

 

-          Mécanisme rapide,

-          Amplification,

-          Liaison du mécanisme à l’état énergétique de la cellule.

 

 

L’entrée du glucose dans la cellule et sa régulation

 

v Les transporteurs du glucose :

 

Le transport est facilité par les transporteurs de glucose : GLUT.

"  C'est–à–dire que le transport se fait dans le sens de la concentration.

 

Il existe 5 membres principaux :    GLUT_1  à  GLUT_2.

Ce sont des glycoprotéines de 500 acides aminés possédant 12 régions hydrophobes :

       "  Insertion dans la membrane plasmique par 12 domaines transmembranaires.

 

Représentation d’un GLUT :

 

y

 
Glycosylation pour protéger des glycoprotéines.

 

Ext

 

 

 

 

 

 

Int

 

NH3+                                                                                                                                              COO–

 

 

Dans les érythrocytes, il y a environ 500 000 molécules de GLUT_1.

 

La famille des transporteurs de glucose :

 

Nom

Localisation tissulaire

Km

Fonction

GLUT_1

Erythrocytes,

Dans tous les tissus

Faible concentration dans le foie et les reins

1 mM

Prélèvement basal de glucose

(minimum vital pour le glucose)

GLUT_2

Cellules b pancréatiques, Foie

15 à 20 mM

Entrée de glucose proportionnelle à la glycémie dans le foie et les cellules b pancréatiques

GLUT_3

Environ tous les tissus

1 mM

Prélèvement basal

(presque même fonction que GLUT_1)

GLUT_4

Cellules musculaires,

Adipocytes

5 mM

Prélèvement insulinodépendant du glucose

GLUT_5

Intestin grêle

 

Transporteur de fructose

Biocapteurs du taux de glycémie :  GLUT_2

 

Flux de glucose

 

Flux max

 

 

 

 

 

 

 

 

                        1              5               10               15                20

                               Glycémie normale

 

GLUT à faible Km :          Par exemple GLUT_1

                                          " Il a une forte affinité au glucose.

       Dans les conditions physiologiques : il y a une quasi–saturation des ces transporteurs.

       "  Dans le cas d’une augmentation de la glycémie, il n’y a aura pas une grande entrée de glucose par ces transporteurs.

 

GLUT à moyen Km :       Par exemple GLUT_4

       Il sert à faire entrer du glucose quand les récepteurs GLUT_1 saturent.

       Il est le seul à être stimulé par l’insuline pour le stockage spécifique du glucose dans les cellules musculaires et adipocytes.

 

GLUT à fort Km :            Par exemple GLUT_2

                                          " Il a une faible affinité au glucose.

       Il sert à faire entrer du glucose quand les récepteurs GLUT_1 saturent. L’entrée est proportionnelle à la concentration du glucose.

 

 

v Mécanisme de transport du glucose :

.Poly p 3.

Il est dit du « pore à soupape ».     

"  Les protéines transmembranaires alternant entre les 2 états conformationnels.

 

v Régulation de l’entrée du glucose par l’insuline :

 

L’insuline stimule l’entrée du glucose dans les cellules (adipocytes et cellules musculaires) en modifiant la distribution subcellulaire des transporteurs du glucose.

 

Son action est très rapide : en 15 min, le flux (= vitesse de passage par unité de surface) est augmenté de 6 à 12 fois.

 

Cette stimulation n’est pas affectée par les inhibiteurs de la synthèse protéique (transcription ou traduction) Elle ne requiert pas de la synthèse protéique.

 

.Poly p 3.

GLUT_4 :

Ces transporteurs sont dans le cytosol. L’insuline provoque la mobilisation des GLUT_1 vers la membrane plasmique et donc leur exocytose. Les transporteurs s’intègrent à la membrane mais n’y restent pas : quand il n’y a plus de stimulation, il y a une endocytose des vésicules transportant les transporteurs.

 

L’insuline a un caractère hypoglycémiant car elle provoque l’entrée du glucose dans les tissus périphériques.

 

 

Régulation de la séquestration intracellulaire de GLUT_4 :

.Poly p 3.

Hypothèse :

Les vésicules contenant GLUT_4 sont séquestrées hors du système constitutif de recyclage des endosomes par l’association avec des « récepteurs de rétention » (RR) localisés sur des structures tubulo–vésiculaires situées à proximité de la membrane.

 

 

 

v Le transport du glucose dans l’épithélium intestinal :

.Poly p 3.

 

 

Régulation de la glycolyse

 

v Identification des enzymes régulatrices :

 

Mise en évidence des mécanismes contrôlant le flux d’une voie métabolique :

 

-          Identification des réactions à vitesse limitante ;

-          Mesure des DG des différentes réactions :

"  Les réactions loin de l’équilibre sont des points de contrôle potentiel ;

-          Identification, in vitro, des effecteurs allostériques des enzymes catalysant ces réactions :

"  Mécanismes mis en jeu ;

-          Mesure des concentrations in vivo des régulateurs présumés :

"  Compatibilité des changements de concentrations dans différentes concentrations avec le mécanisme de contrôle proposé.

 

v Régulation de l’activité des enzymes clés :

Ø  Régulation de l’hexokinase et de la glucokinase :

§  Inhibition allostérique par le G–6è :

 

La phosphorylation est assurée par des kinases :

-          Le Km pour le glucose :   

Hexokinase  "  0,1 mM

Glucokinase "  5 mM

-          Comportement de l’enzyme :

L’hexokinase :            mickaelien

Glucokinase :  allostérique

 

La glucokinase est l’exception des enzymes allostériques car la glucokinase est monomérique.

 

Stimulation par le glucose :

 

       Vitesse / Vmax

 


                      1                                                                       Hexokinase (ubiquiste)

 

                                                                                            Glucokinase (cellules hépathiques,

                   0,5                                                                                         cellules b pancréatiques)

 

 

                                                                                                        [Glucose] en mM

                          0                   5                  10                    15

 

 

 

Inhibition par le glucose–6è :

 

                   Vitesse

 


                                                                                               Glucokinase (indifférente)

 

 

 

 

                                                                                              Hexokinase

 

                                                                                                        [Glucose–6è]

 

Le glucose_6è ne présente aucune inhibition sur l’activité de la glucokinase, donc l’activité glucokinase est proportionnelle à la quantité de glucose qui entre dans la cellule.

 

§  Activation allostérique par le phosphate minéral Pi :

Elle ne concerne que l’hexokinase.

 

Cette activation est indirecte : le Pi fait diminuer l’affinité pour le glucose_6è et donc permet la levée de l’inhibition par le glucose_6è de l’hexokinase.

 

§  Régulation de la glucokinase hépatique :

 

Exemple de cycle futile : le cycle Glucose – Glucose_6è :

                     Pi                                          Glucose                                         ATP

 

                         Glucose_6_phosphatase                             Glucokinase

 

                   H2O                                    Glucose_6è                                    ADP

 

Þ     ATP  +  H2O  "  ADP  +  Pi

 

La chaleur dépensée dans ces réactions permet à l’organisme de maintenir sa température corporelle.

 

Le foie est consommateur et producteur de glucose. Ce dernier ne doit donc pas être consommé par la glucokinase (GK) ; il faut éviter la mise en place de ce cycle.

Pour cela, la cellule hépatique a mis en place un mécanisme de régulation particulier où elle séquestre cette activité dans le noyau.

 

-                     La GK est localisée dans le noyau des hépatocytes ; elle y est inefficace.

-                     L’augmentation de la concentration intracellulaire en glucose entraîne la translocation de la GK dans le cytosol.

-                     La GK phosphoryle le glucose.

-                     Il y a ensuite une séquestration nucléaire grâce à la fixation à une GKRP (Glucokinase Regulatory Proteins)

Ce mécanisme permet la limitation de l’action catalytique de la GK en période de jeûne 

(le cycle futile est minimisé)

Il y a ainsi une sécrétion hépatique du glucose.

 

Ce rôle régulateur est limité :

-          Le glucose_6è est à l’origine de plusieurs voies métaboliques (synthèse du glycogène, voies des pentoses–phophates)

-          Il n’y a pas de rôle si le glucose est fourni par la dégradation du glycogène, car la glycogénolyse fournit du glucose_1è.

 

Le glucose–è est un carrefour métabolique :

 

Glucose

                                                                               ATP

                                                 Hexokinase

                                                                               ADP

Glucose_6è

 

 

Glucose_1è                                Fructose_6è                        6_phosphogluconate

 

 

Glycogène                                     Pyruvate                                 Ribose            

        " Stockage                            " ATP, Biosynthèse              " NADPH, Synthèse nucléotidique

 

 

§  La glucokinase = détecteur de glucose dans les cellules b pancréatiques :

.Poly p 4.

La GK est l’étape limitante de la glycolyse dans ces cellules.

Þ C’est une véritable sonde métabolique qui renseignent sur la glycémie des cellules b.

 

 

Le glucose entre dans la cellule

ß

Il est transformé en pyruvate avec la création d’ATP ;

ß

L’ATP entraîne la fermeture de canaux K+ (sensibles à l’ATP) ;

ß

Une dépolarisation membranaire est déclenchée ;

ß

Des canaux Ca2+ s’ouvrent, permettant l’entrée des ions Ca2+ ;

ß

Le Ca2+ provoque l’exocytose de vésicules (migration vers la membrane) ;

ß

Libération d’insuline.

Des mutations de la GK sont associées à une des formes du diabète non insulino–dépendants.

 

-          Aux USA, 1 individu sur 2400 hétérozygotes porte des mutations de gène de la GK.

-          Ces mutations seraient une des principales causes de l’apparition de diabète non insulino–dépendant.

 

Baisse d’activité de la GK dans les cellules b pancréatiques

ß

Augmentation du seuil de sensibilité vis–à–vis du glucose (pour la synthèse d’insuline)

ß

Diminution de la synthèse d’insuline

ß

Baisse du prélèvement hépatique du glucose et du catabolisme glucidique hépatique concomitant à une augmentation de la production hépatique de glucose.

 

 

Ø  Régulation de la phosphofructokinase 1 (PFK 1) :

 

Glycolyse :

Glucose

                                                                               ATP

                                                 Hexokinase

                                                                               ADP

Glucose_6è

                                                                               

                                     Phosphoisomérase

                                                                               

Fructose_6è

                                                                               ATP

                                                        PFK 1                                  (= PhosphoFructoKinase 1)

                                                                               ADP

Fructose_1,6 diè

                                                                               

                                                      Aldolase

                                                                               

Glycéraldéhyde

 

 


DHAè

 

La PFK 1 est une enzyme allostérique :

-          Elle catalyse la réaction la plus lente ;

-          Elle oscille entre 2 états conformationnels T et R.

 

Elle se situe dans le cytosol et est composée de 4 sous–unités identiques (= homotétramère) :

-          4 x 83 000 Da  (chez les eucaryotes),

-          4 x 41 000 Da  (chez les procaryotes)

 

§  Inhibition allostérique :

 

Il s’agit d’un rétrocontrôle négatif par des indicateurs de charge énergétique forte : ATP, citrate, NADH.

 

·         ATP :

Fructose_6è

                                                                               ATP

                                                        PFK 1                                  (= PhosphoFructoKinase 1)

                                                                               ADP

Fructose_1,6 diè

                   Vitesse

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                                                                     [ ATP ]

 

Sur la PFK 1, il existe 2 sites de fixation de l’ATP :

-          Un site catalytique avec une forte affinité, pour de faibles concentrations de glucose et d’ATP ;

-          Un site allostérique avec une faible affinité, pour de fortes concentrations de glucose et d’ATP ;

Quand il y a de fortes concentrations en ATP, ce dernier se fixe uniquement sur le site allostérique.

 

                   Vitesse

                                                                  Faible [ATP]

                      Vm

 

                                                                              Forte [ATP]

 

 

 

 

                                                                                                     [fructose_6è]

                                               Km1        Km2

 

L’ATP est un inhibiteur allostérique hétérotrope de la PFK 1.

" Quand il y a fixation de l’ATP sur la PFK 1, il y a une baisse d’affinité de celle–ci pour l’autre substrat.

 

Charge énergétique  = 

Vitesse relative des réactions

                                                                                                            Réaction utilisation de l’ATP

                    

 

 

 

                                                                                                     Réaction produisant de l’ATP

 

 

                                                                                                                 Charge énergétique

                               0              0,25             0,5              0,75          1

 

"  La glycolyse se réalise dans n’importe quelle condition ; elle régule la charge énergétique de la cellule.

 

La concentration en ATP est maintenue à peu près constante grâce à 2 réactions :

 

                                                      Créatine kinase

ATP  +  créatine                                           phosphocréatine  +  ADP

                                                          DG » 0

 

                                                      Adénylate kinase (ou myokinase)

2 ADP                                                ATP  +  AMP

 

 

 

Concentration

avant la consommation d’ATP

Concentration

après la consommation d’ATP

Changement relatif

(en %)

ATP

5 mM

4,5 mM

10 %

ADP

1 mM

1 mM

0 %

AMP

0,1 mM

0,6 mM

600 %

 

Problème :

La concentration d’ATP varie peu  (± 10%) mais le flux glycolytique varie de 1 à 100.

"  Il y a d’autre(s) mécanisme(s) que la régulation allostérique par l’ATP.

 

·         Citrate et NADH :

 

Ce sont 2 inhibiteurs allostériques de PFK 1 qui renforcent l’effet inhibiteur  d’ATP.

 

 

§  Activation allostérique :

·         AMP :

 

C’set un activateur hétérotrope : il modifie, en diminuant, l’affinité de l’enzyme vis–à–vis de son inhibiteur allostérique : l’ATP.

 

 

                   Vitesse

                                                      Faible [ATP]              Fort [ATP] + Faible [AMP]

 

 

                                                                              Forte [ATP]

 

 

 

 

                                                                                                     [fructose_6è]

 

L’AMP se lie préférentiellement à l’état R.

 

Un signal métabolique consistant en la diminution de la concentration de l’ATP, insuffisant pour lever l’inhibition exercée sur la PFK 1, est amplifié significativement grâce à la réaction de l’adénylate kinase.

 

Mais l’amplification de la stimulation de la PFK1 exercée par l’AMP est insuffisante pour expliquer l’augmentation (par un facteur sup. à 100) du flux glycolytique.

 

"  Il existe donc un autre mécanisme activateur.

 

 

·         Fructose 2,6–biphosphate :

¨      Activateur allostérique majeur de la PFK 1 :

 

 

Activité de la PFK 1 (en %)

 


                      100  

                                                      + Fruct 2,6 diè

                        75                                                        – Fruct 2,6 diè

 

                        50  

 

                        25  

                                                                                                                

                          0

                                   0,5                                      2                      [Fructose 6è]  (en mM)

 

 

Ce n’est pas la vitesse de réaction qui change, mais l’affinité de l’enzyme pour son substrat.

 

"  La PFK1 est une enzyme allostérique du système K.

 

 

 

   Vitesse                                                                     Vitesse

                               + Fruct 2,6 diè

      

                                                                                          + Fruct 2,6 diè

                  

                              

                                           – Fruct 2,6 diè                                – Fruct 2,6 diè

 

 

 

 


                                          [AMP]  (en mM)                                                                    [ATP]

 


"  Augmentation de l’affinité de l’enzyme pour son autre activateur allostérique, l’AMP.

"  Diminution de l’affinité de l’enzyme pour son inhibiteur allostérique, l’ATP.


 

 

¨      Métabolisme assuré par une enzyme fonctionnelle :

 

   ATP                                                     ADP

Phosphofructokinase 2 (PFK 2)

Fructose_6è                                                                   Fructose_2,6 diè

Fructose 2,6 diphosphatase

     Pi                                                        H2O

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


La PFK 2 phosphorylée bloque la synthèse de Fructose_2,6 di è

ß

Absence d’activation de la PFK 1

ß

Diminution de l’utilisation cellulaire du glucose

ß

Diminution du prélèvement du glucose circulant

ß

Augmentation de la glycémie

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


L’insuline favorise l’activation de la PFK 2

&

La diminution de l’activité du catalyseur de la PFK 2

ß

Augmentation de la glycolyse

ß

Augmentation de l’utilisation cellulaire du glucose

ß

Diminution de la glycémie

 

 

Les 2 activités enzymatiques distinctes sont portées par une enzymatique unique bifonctionnelle. Il s’agit d’une enzyme bifonctionnelle est un dimère (2 sous–unités de 55 kDa), dont chaque sous–unité est bifonctionnelle.

 

 

La bifonctionnalité est démontrée par :

-          L’utilisation :

-          Des agents oxydants :      

"  Diminution de l’activité kinase, mais l’activité phophatase est épargnée.

-          Des agents alkylants (para–mercuribenzoate) :   

"  Augmentation de l’activité kinase, mais diminution de l’activité phophatase.

-          De l’ADP :           

"  Diminution de l’activité kinase, mais l’activité phophatase est épargnée.

-          L’application d’une protéolyse limitée (thermolysine, trypsine) :           

"  Absence de l’activité kinase, mais l’activité phophatase est épargnée.

-          La détermination de la séquence primaire :       

"  Mise en évidence de 2 domaines indépendants.

 

¨      Régulation par phosphorylation–déphosphorylation des activités kinasique–phosphatasique :

 

AMPc

ß

PKA

ß

Phosphorylation d’une sérine par sous–unité

ß

Diminution de l’activité kinasique

&

Augmentation de l’activité phosphatase

 


Activité kinasique

Activité phosphatasique


 

 


                                                                     Vmax

 

 

 

                                                                     Vmax

 

 

 

               Km         Km                                                        Km (constant)


Inhibition compétitive

Inhibition non compétitive


Propriétés de la PFK 2 :

 

-          Elle a une stricte spécifique par rapport au D_Fructose_6è.

-          Il n’y a pas d’inhibition par l’ATP, à la différence de la PFK 1.

 

 

 


Inhibition compétitive

Inhibition non compétitive

 

 

 

 

 

 

Double rôle du citrate :

 

Il est l’inhibiteur allostérique de la PFK 1 et de la PFK 2. Il entraîne une baisse de la concentration du fructose_2,6 diè et permet ainsi d’inhiber fortement la glycolyse.

 

Propriété du fructose–2,6 diè :

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Régulation du taux du F_2,6 diè :

.Poly p 4.

Le Pi entraîne une augmentation du KInhibiteur du frutcose_6è

ß

Levée partielle de l’inhibition exercée par la fructose_6è

 

Þ L’activation de cet inhibiteur allostérique va stimuler la glycolyse.

Le niveau de phosphorylation va régler les activités phosphatasiques et kinasique.

 

Intérêt d’une régulation concertée dans les cycles futiles :

 


                                          12                                                       10

                        A                B                          A                B

                                          13                                                       16

 

                                  Flux net  =  1                                      Flux net  =  6

 

"  Une modification de 25% des activités enzymatiques induit une augmentation de 500% du flux métabolique. Cela permet une régulation très fine des métabolismes cellulaires.

 

 

Régulation hépatique de la glycolyse :

.Poly p 5.

2 hormones hyperglycémiantes (adrénaline et glucagon) vont activer la protéine kinase A (PKA) qui va phosphoryler l’enzyme bifonctionnelle :

-          Diminution de l’activité kinasique,

-          Augmentation de l’activité phosphatasique.

 

Le fructose_2,6 diè est incapable d’agir comme inhibiteur allostérique car sa concentration est trop faible.

       "  Il participe à une étape limitante.

 

La chute de la vitesse du flux glycolytique permet de préserver le glucose formé pour le relarguer dans la circulation.

.Poly p 5.

Le récepteur insuline entraîne une cascade de signaux « kinasiques » et l’activation de certaines activités enzymatiques dont la phosphatase.

-          L’insuline régule l’activité phosphodiestérase formant l’AMP non cyclique incapable d’activer la PFK 1.

-          Elle s’oppose au glucagon et l’adrénaline :

-         En diminuant le taux de l’AMPc.

 

En déphosphorylant l’enzyme bifonctionnelle, son activité phosphatasique est diminuée.

Des fortes concentrations [F_2,6 diè] stimulent la PFK 1.

"  L’insuline a un rôle hyperglycémiant car elle favorise l’utilisation du glucose.

 

Régulation hépatique de la glycolyse :

.Poly p 5.

Structure primaire des enzymes bifonctionnelles dans le foie et le cœur :

.Poly p 5.

 

Dépendance du flux glycolytique vis–à–vis de quelques enzymes :

 

       Flux glycolytique :

                               0,09

                                                                  Glucokinase

                               0,06

 

                               0,04

                                                                  PFK 1

                               0,02    

                                                                                                                 Phosphokinase isomérase

                                    0

                                                          1                  2                 3        Quantité d’enzyme ajoutée

 

Le facteur limitant de la glycolyse (dans le foie) est la 1ère réaction, c'est–à–dire la transformation du glucose en glucose_6è.

 

Conditions expérimentales :

-          Homogénat de tissu hépatique (quantité fixe),

-          Additions de concentrations croissantes d’enzymes purifiées,

-          Mesure de la quantité de fructose_1,6 diè formé

 

 

Plus on ajoute de la glucokinase, plus on stimule la transformation du glucose en fructose_1,6 diè.

La PFK 1 est fortement régulée, elle a un rôle important à court terme.

 

 

Ø  Régulation de pyruvate kinase (PK) :

§  Les isoenzymes de la PK :

 

On trouve 3 isoenzymes :              M        localisée dans le muscle et le cerveau,

                                                      A         localisée dans les tissus adipeux,

                                                      L          localisée dans le foie et le rein.

 

Seule l’isoenzyme L est soumise à régulations allostérique et par phosphorylation.

 

§  Régulation allostérique :

·         Inhibiton allostérique (ATP, NADH, citrate, alanine) :

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Le mécanisme de rétrocontrôle négatif par l’alanine est très important dans la période de jeûne.

 

Cycle glucose – alanine :Diagramme cyclique

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

L’alanine va servie de substrat dans la néoglucogenèse et inhiber fortement la glycolyse hépatique

·         Activation allostérique (ADP, fructose–1,6 diè) :

 

Vitesse

                                                                                         + Fructose_1,6 diè

 

                                                                                         – Fructose_1,6 diè

                                                                              " Augmentation de l’activité de l’enzyme

 

 

 

                                                                                         [ PEP ]

Le fructose_1,6 diè permet une activation par anticipation.

 

§  Régulation par phosphorylation–déphosphorylation :

 

Régulation de la PK :

.Poly p 4.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Vitesse

 

 


Pyruvate kinase déphosphorylée

 

Pyruvate kinase phosphorylée

 

 

 

                                                                                         [ PEP ]

 

"  L’activation fait augmenter l’affinité pour le substrat.

 

-          La forme déphosphorylée est plus sensible aux activateurs allostériques comme le fructose_1,6 diè,

-          La forme phosphorylée est plus sensible aux inhibiteurs allostériques comme l’alanine.

-          La phophatase est stimulée par l’insuline,

-          Le fructose_1,6 diè freine la phosphorylation de la PK.

 

 

Ø  Régulation à long terme des enzymes clés :

 

Elle se fait sur la glucokinase, la PFK 1 et la PK.

 

 

Influence de l’alimentation :

 

 

Glucokinase

PFK 1

PK

Alimentation glucidique

&

Augmentation

&

Augmentation

&

Augmentation

Jeûne glucidique

((

Forte baisse

(

Baisse

(

Baisse

 

 

 

Rôle des hormones dans la régulation transcriptionnelle des enzymes clés de la glycolyse :

 

 

Glucokinase

PFK 1

PK

Enzyme bifonctionnelle

Glucagon

(

(induction par l’insuline)

?

(

(induction par l’insuline et le glucose)

(

Insuline

&

&

&

(+ glucose)

Restauration de l’activité

Diabète

((

(

(

(

 

 

 

N. B :

 

 

La glucokinase des cellules pancréatiques est insensible à l’insuline.

 

La glucokinase pancréatique est un détecteur de glucose.

ß

Contrôle du flux glycolytique

ß

Contrôle du ratio ATP /ADP responsable de la synthèse d’insuline.

 

 

Régulation de la glycogénolyse

 

v Rappels :

Ø  Structure du glycogène :

 

Le glycogène constitue la principale forme de stockage des glucides chez les animaux.

 

Réserves glucidique chez l’homme adulte normal :

 

-          Glycogène hépatique :                 4% du poids frais        soit 7,2 g         (1,5 kg)

-          Glycogène musculaire :               0,7% du poids frais     soit 245 g        (35 kg)

-          Glycogène extracellulaire :          0,1% du poids frais     soit 10 g          (10 L)

 

 

Contenu hépatique en glycogène :

                                           Variation nycthémérale du contenu hépatique en glycogène

       (à partir d’une population américaine normale)

 

 

 

 

 

 

 

8H               12H                  16H                  20H                  24H                  4H                    8H       

Réserves énergétiques d’un homme normal (en kCal) :

 

-          Glycogène hépatique :             280

-          Glycogène musculaire :            480

-          Glycose extracellulaire :             80

-          Lipides :                            135 000

-          Protéines :                          24 000

 

Il existe 2 types de liaison glucosidique :

-          Liaison a_1,4 :

 

 

-          Liaison a_1,6 :

 

 

 

 

 

La structure ramifiée du glycogène est due à ses 2 types de liaison.

Le glycogène est stocké dans le cytosol sous forme de granules. Ces dernières présentent un diamètre de 100 à 400 Å et contient jusqu’à 120 000 unités de glucose.

Le PM du glycogène va jusqu’à 2.107 Da.

 

L’intérêt physiologique du glycogène est sa dégradation rapide.

 

Mais alors, pourquoi stocker le glucose pour les réserves énergétiques,

alors que l’on a beaucoup plus de lipides ?

 

-          Mobilisation plus rapide du glycogène dans le muscle,

-          Pas de métabolisme des AG en anaérobiose,

-          Pas de conversion des AG en glucose.

 

"  Le métabolisme des lipides ne peut assurer seul le maintien de la glycémie.

 

Ø  Réaction de la glycogénolyse :

 

Phosphorylase du glycogène

(glucose)N  +  Pi                                                    (glucose)N+1  +  Glucose_1è

 

 

Dans la cellule :          [Pi] / [G_Iè]  =  100

                   "  Réaction est pratiquement irréversible.

 

DG = 0            quand  [Pi] / [G_Iè]  »  3,5

 

.Poly p 6.

 

La phosphorylase catalyse la coupure des liaisons a_1,4 du glycogène des extrémités non réductrices (= absence du C1–OH)

Il ne s’agit pas d’une hydrolyse, mais d’une phosphoralyse.

 

L’action de la phosphorylase du glycogène s’arrête au voisinage dans les liaisons a_1,6 (quand il reste 4 résidus glucose avant une ramification)

 

 

D’autres enzymes interviennent :

-          a_1,4 glucanne transférase :   Transfert des 3 unités sur la chaîne linéaire,

-          a_1,6 glucosidase :   Elimination du glucose lié à la chaîne en a_1,6.

 

Ce sont des enzymes bifonctionnelles. Elles sont dites des enzymes débranchantes.

 

Dégradation du glycogène :

-          90% en glucose_1è,

-          10% en glucose.

 

 

v Régulation des enzymes de la glycogénolyse :

Ø  Phosphorylase du glucogène musculaire :

.Poly p 6.

La phosphorylase du glycogène est un dimère constitué de 2 sous–unités.

Le site de fixation du glycogène peut être loin du site catalytique. La distance entre ces 2 sites correspond à 4 unités de glucose.

 

§  Régulation allostérique de la phosphorylase b :

.Poly p 6.

La phosphorylase b correspond à l’état déphosphorylé de la phosphorylase du glycogène.

 

§  Régulation par phosphorylation–déphosphorylation :

.Poly p 7.

                                          Phosphatase

Phosphorylase a                                      Phosphorylase b

                   La phosphatase kinase phosphoryle les résidus Sérine.

 

Il faut que la phosphorylase b soit sous sa forme T pour qu’elle soit phosphorylée. Il y a, en plus, des régulations allostériques.

 

La phosphorylase a phosphorylée est très sensible à l’AMP.

 

 

§  Régulation de la phosphorylation (phosphorylase kinase) :

 

La phosphorylase kinase phosphoryle les résidus a et b.

Par cette cascade, il y a une forte amplification de la PKA.

.Poly p 7.

La phosphorylase kinase est un hétérotétramère  (4 sous–unités)

 

.Poly p 7.

La sous–unité d est la calmoduline (CaM) :

 

Sa fonction est de fixer le Ca2+ de l’organisme ; elle donc très importante.

Elle est constituée de 148 acides aminés et est présente dans toutes les cellules de l’organisme.

 

                               Ca2+                                                    Ca2+

 

 

                               Ca2+                                                    Ca2+

 

Les 4 ions Ca2+ viennent se fixer.

 

Le Ca2+ qui se lie induit des changements conformationnels :

-          Dévoilement d’une plage hydrophobe riche en Métionine,

-          Formation de liaison de forte affinité avec le domaine de liaison à la calmoduline de certaines protéines,

-          Modulation de l’activité de ces protéines.

 

La sous–unité g porte le site catalytique qui permet la phosphorylation de certains substrats.

 

Fixation du Ca2+ fixé avec la sous–unité d

ß

Modification de l’activité de la sous–unité g

ß

Les résidus Sérine des sous–unités a et b deviennent accessibles

ß

La protéine kinase A peut alors phosphoryler la sous–unité b

ß

Autre changement conformationnel

ß

Phosphorylation de la sous–unité a

ß

Dévoilement plus important de la Sérine phosphorylée de la sous–unité b

ß

Inhibition de l’activité de la phosphatase kinase

 

Þ  L’action des phosphatases (PP1) qui déphosphorylent le résidu Sérine entraîne l’inhibition de l’activité de la phosphatase kinase.

 

 

A Noter :

La structure de la calmoduline est similaire à celle de la troponine C (70% d’homologie)

"  L’activation de la glycolyse et l’induction de la contraction musculaire sont réalisées par des protéines similaires liant le Ca2+.

 

Þ  Il y a synchronisation des 2 processus.

 

 

§  Régulation de la déphosphorylation (PP1) :

.Poly p 7.

·         Activation :

 

Elle doit être phosphorylée sur au moins 1 des 2 sites. Elle est phosphorylée par la protéine kinase A sous l’action de l’insuline.

 

Mais il existe un 2ème mode de phosphorylation par la PKA :

 

Elle conduit à une double phosphorylation qui entraîne des modifications

ß

La PP1 s’éloigne du voisinage du glycogène

ß

Inactivation de la PP1

&

Activation de la glycogénolyse

 

·         Inactivation de la PP1 par l’AMPc :

.Poly p 8.

Elle se fait par l’action d’une protéine inhibitrice qui fixe avec une forte affinité la sous–unité catalytique quand cette protéine est phosphorylée.

 

La PP1 ne peut plus se fixer sur la sous–unité régulatrice. L’activité de la PP1 reste dans le cytosol et donc au voisinage du glycogène. La PP1 peut se refixer à R par l’action de l’insuline.

 

§  La PP1 comme exemple de ciblage subcellulaire :

·         Considérations générales sur les (Ser/Thr) phosphatases :

 

Il existe beaucoup plus de Ser/Thr kinases (pour la phosphorylation) que de Ser/Thr phosphatases (pour la déphosphorylation) différentes chez les vertébrés.

 

Chez l’homme, le rapport kinases/phosphatases = 20

"  L’évolution s’accompagne d’une diversité croissante des Ser/Thr kinases mais pas des Ser/Thr phosphatases (dont le nombre reste à peu près constant au cours de l’évolution)

 

Comment assurer une spécificité d’action de ces phosphatases ?

 

Il y a peu de diversité des sous–unités catalytiques mais chaque sous–unité catalytique est capable de réagir avec de multiples sous–unités régulatrices.

 

Exemple :

       La PP1 et la PP2A interagissent avec plus de 100 polypeptides différents.

"  Génération d’holoenzymes différentes avec des spécificités d’action et des localisations différentes.

 

 

·         Ciblage subcellulaire des phosphatases :

 

Le contrôle précis du large spectre d’activité des phosphatases est obtenu en restreignant l’action de ces enzymes in vivo.

 

Ce contrôle est exercé par des protéines de nature variée qui, en interagissant à la fois avec d’autres molécules et avec des phosphatases, vont se comporter comme des sous–unités de ciblage (targeting subunit) des phosphatases.

La phosphatase ne pourra déphosphoryler que les substrats situés à proximité immédiate de la sous–unité de ciblage sur laquelle elle est fixée.

 

Ces sous–unités de ciblage contrôlent l’activité catalytique des phosphatases.

 

 

Ciblage subcellulaire :

.Poly p 8.

1)      En confinant l’enzyme dans les zones précises de la cellule.

2)      En modifiant allostériquement les propriétés catalytiques et/ou régulatrices de l’enzyme.

"  Ces 2 effets étant réversibles.

 

D Il n’y a pas de régulation par le Ca2+ de la phosphorylase kinase, contrairement à la PK musculaire.

 

 

 

Ø  Phosphorylase du glucogène hépatique :

 

Elle présente une structure différente de la phosphorylase musculaire mais a une régulation quasi identique :

-          Régulation par phosphorylation – déphosphorylation,

-          Régulation allostérique :

-          De la phosphorylase b (comme avec la phosphorylase musculaire),

-          De la phosphorylase phosphatase.

 

Phosphorylase a                                                              Phosphorylase b

                                                      Phosphorylase phosphatase

       Inhibition

                               AMP                                                                          Glucose

                                                                  Activations

                                          Insuline                      Glucocorticoïdes (cortisol)

 

 

L’action inhibitrice est majeure par rapport aux autres actions.

 

 

Régulation de la Glycogénogenèse

 

v Rappels :

Ø  Réactions de la glycogenèse :

.Poly p 9.

La Glycogène synthétase (GS) est soumise à régulation.

 

Ø  Mécanisme de ramification du glycogène :

.Poly p 9.

L’enzyme branchante transfère une partie du glucose de la chaîne latérale sur la chaîne linéaire en formant une liaison a_1,6.

 

Ø  La glycogènine :

 

Il s’agit du « primer » de la synthèse du glycogène, en permettant l’initiation de la glycogénogenèse.

C’est un polypeptide de 332 acides aminés.

 

 

 

 

 


                                                                  8 (UDP_glucose)

       Glycosylation spontanée

                                                                  8 UDP

 

 

 

 

                                                                  n (UDP_glucose)

Glycogène synthétase et

       Enzymes débranchantes                    n UDP

 

 

 

 

v Régulation de la glycogène synthétase :

Ø  Par phosphorylation :

.Poly p 9.

-          La glycogène synthétase (GS) est active quand elle est déphosphorylée :  GS a.

-          Quand elle est phosphorylée, elle est inactive :  GS b.

-          La GS peut être phosphorylée par 6 kinases différentes (PKA, PKC, GSK3, CK1 et 2, ISPK)

 

§  Sites de phosphorylation multiples dur la GS :

.Poly p 10.

Tous les sites de phosphorylation n’ont pas le même poids. Il existe :

-          Des sites primaires,

-          Des sites secondaires.

 

Les sites IAIRES entraînent aucune modification apparente de l’activité de la GS. Il faut qu’ils soient phosphorylés pour entraîner la phosphorylation des sites IIAIRES.

"  Inactivation de la GS.

 

Différences entre la GS musculaire et la GS hépatique :

-          La GS musculaire :

La phosphorylation entraîne la baisse de la vitesse max.

-          La GS hépatique :

La phosphorylation entraîne la baisse d’affinité pour l’UDP–glucose.

Il y a aussi une absence de 2 sites de phosphorylation apr la PKA dans la GS hépatique. Mais le glucagon reste le principal inactivateur physiologique de la GS hépatique.

 

 

Ø  Par phosphorylation :

.Poly p 10.

N.B :

L’insuline stimule la GS mais prépare aussi son inactivation ultérieure par phosphorylation d’un site de phosphorylation IAIRE.

 

 

Ø  Par contrôle allostérique :

.Poly p 10.

Seule la forme b (phosphorylée) est contrôlée allostériquement.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


La concentration en glucose_6è, dans le muscle, est de 0,2 à 0,4 mM.

"  La glycogène synthétase b in vivo est quasiment inactive.

 

Þ  L’activité de la GS in vivo dépend de la proportion d’enzyme non phosphorylée (sur les sites secondaires)

v Régulation coordonée de la glycogénolyse et de la glycogénogenèse :

.Poly p 10.

La mobilisation des réserves glucidiques entraîne une augmentation de la glycogénolyse et donc une inhibition de la glycogénogenèse par les enzymes.

 

On observe le phénomène inverse avec l’insuline :

                   Glycogénogenèse favorisée,

                   Glycogénolyse inhibée.

 

v Action glycogénogenèse du glucose :

.Poly p 11.

Ø  Inactivation de la phosphorylase a et activation de la PP 1 et de la GSa :

 

Dans le foie, la phosphorylase a joue le rôle de la glucokinase :   Détecteur de glucose.

 

Une fois le glucose fixé sur la phosphorylase a :

-          Inhibition compétitive du glucose,

-          Fixation sur le site allostérique.

" Changement conformationnel :   Meilleure accessibilité des résidus Ser–è pour les phosphatases.

Les phosphatases accèdent à leur substrat    "  Déphosphorylation de la phosphorylase a.

 

En même temps de l’inactivation de la phosphatase a :       

"  La PP 1 est débarrassée de son inhibiteur allostérique.

 

Þ  Il n’y a pas d’instauration simultanée de la synthèse et de la dégradation du glycogène.

 

 

L’activation de la GS requiert le glucose_6è :

 

Certains analogues non métabolisables du glucose entraînent une diminution d’activité sur la phosphatase mais n’ont pas d’action sur la GS.

 

Le 2_désoxyglucose agit comme le glucose :   Baisse d’activité de la phosphatase,

                                                                       Augmentation d’activité de la GS.

"  Le glucose_6è est requis.

 

L’inhibiteur de la glucokinase entraîne une baisse de la GS.

Le glucose_6è stimule de la déphosphorylation de la GS.

 

Important :  L’inactivation de la phosphatase a est un pré requis pour l’activation de la GS par le glucose_6è

 

Le glucose augmente la transcription des gènes impliqués dans son métabolisme.

 

Ø  Augmentation de l’expression de GLUT–2 :

 

Le glucose crée une augmentation de l’expression de GLUT–2.

Les effets transcriptionnels du glucose sont médiés par le xylulose_5è (intermédiaires du cycle des pentoses–phosphates)

 

Ø  Régulation des voies de signalisation :

 

Le glucose activerait certaines voies de signalisation.

L’activation de la GS par le glucose est partiellement bloquée par la wortmannine (inhibition de la PI3–kinase)

La PI3–kinase médie l’action de l’insuline sur la GS en inactivant la GSK3.

 

Ø  Contrôle de la localisation subcellulaire de certaines enzymes glycogénogenèses :

 

Le glucose contrôle la localisation subcellulaire de certaines enzymes glycogénogenèses (glucokinase, GS) et de la glycogénine.

 

 

"  Création d’un complexe glycogénogenèse regroupant la glycokinase, GS et glycogénine associé aux microfilaments d’actine.

 

 

Régulation de la gluconéogenèse

 

v Rappels sur les réactions de la gluconéogenèse :

 

Schéma simplifié des voies de la gluconéogenèse :

.Poly p 12.

La gluconéogenèse se déroule principalement dans le tissu hépatique et le rein.

 

2 cycles impliqués dans la gluconéogenèse hépatique :

.Poly p 12.

Néoglucogenèse :

.Poly p 12.

La gluconéogenèse est un gaspillage énergétique indispensable.

 

                                          + 6 ATP

2 Lactate                                1 Glucose

 

Mais l’ATP requis est fourni par oxydation des acides gras (AG)

Les conditions métaboliques requises pour l’initiation de la gluconéogenèse correspondent aux conditions, elles–même, correspondant à une liberté accrue d’AG dans la circulation.

 

"  Oxydation mitochondriale hépatique :

                                          "  Corps cétoniques,

                                          "  ATP (glucose)

 

Voies de la gluconéogenèse :

.Poly p 13.

                   GOT  =           Glutamate Oxaloacétate Transaminase

                   MDH  =          Malate DéHydrogénase

                   LDH  =           Lactate DéHydrogénase

 

Régulation transcriptionnelle coordonée de la glycolyse et de la gluconéogenèse :

.Poly p 13.

 

 

v Régulation des activités des enzymes de la gluconéogenèse :

Ø  La Pyruvate Kinase (PK) :

 

C’est une enzyme mitochondriale (chez les mammifères) ou cytosolique (chez les levures et bactéries)

 

Chez les mammifères :

C’est une protéine homo–tétramérique, avec 4 chaînes identiques de 1178 acides aminés, et un PM de 4 x 130 kDa (= 520 kDa)

Elle est régulée par l’acétyl_CoA, comme la quasi–totalité des carboxylases.

§  Activation allostérique :

·         Par l’acétyl_CoA :

Chez les mammifères.

Enzyme_biotine  +  ATP  +  HCO3–

+ Acétyl_CoA

+ Mg2+

Enzyme_biotine–CO2  +  ADP  +  Pi

+ Pyruvate

Enzyme_biotine  +  OAA

 

La biotine permet la catalyse.

Par contre, chez la levure, l’activation de la PK se fait par les acides gras à longue chaîne.

 

                               Vitesse                         + Acétyl_CoA

                          Vmax

  – Acétyl_CoA

 

 

 

 

                                                                                                     [HCO3–]

                                               Km       Km

 

"  Implication dans l’autorégulation du métabolisme intermédiaire.

 

-          Une charge énergétique crée un ralentissement du cycle de Krebs et donc une augmentation de la concentration de l’acétyl_CoA.

"  Activation de la pyruvate carboxylase (PC) et augmentation de la synthèse du glucose.

-          Un déficit en OAA entraîne augmentation de la concentration de l’acétyl_CoA.

"  Activation de la synthèse d’OAA et augmentation du cycle de Krebs.

-          La b_oxydation (en période de jeûne) entraîne augmentation de la concentration de l’acétyl_CoA.

"  Activation de la pyruvate carboxylase (PC) et inhibition de la pyruvate déshydrogénase (PDH)

 

·         Par l’ATP :

 

§  Inhibition allostérique par l’ADP :

 

Ø  La fructose–1,6 diphosphatase :

 

C’est une enzyme tétramérique.

 

Il n’existe pas de coopérativité vis–à–vis du substrat (fructose_1,6 diè)

                   "  Comportement mickaelien vis–à–vis du sbstrat.

Elle a un comportement allostérique vis–à–vis des effecteurs allostériques.

 

Il y a la nécessité de Mn2+ et Zn2+ pour la catalyse.

 

                               Vitesse            

                          Vmax

 

 

 

 

                                                                                         [Fructose_1,6 diè]

 

§  Activation allostérique :

 

Elle se fait par l’ATP, le NAD réduit et le citrate.

Elle favorise la transformation allostérique de l’enzyme vers sa forme catalytique.

De plus, il y a une stabilisation de la forme R (active) favorisée par le substrat (fructose_1,6 diè) et le fructose.

 

§  Inhibition allostérique :

 

Elle se fait par l’AMP (et non l’AMPC) et le fructose_2,6 diè.

 

·         L’AMP :

 

Elle favorise la transition de la forme R vers la forme T (moins active)

L’effet est variable suivant les espèces.

L’AMP est efficace chez les mammifères, mais sa concentration varie peu.

 

                               Vitesse            

                          Vmax

 

 

 

 

                                                                                         [AMP]

 

·         Le fructose–2,6 diè :

 

                               Vitesse            

                          Vmax

 

C’est l’inhibiteur allostérique majeur.

 

 

                                                                                         [AMP]

 

Le fructose_2,6 diè est à la fois activateur de la glycolyse et inhibiteur de la gluconéogenèse.

 

Cette double régulation par la même molécule fait que la glycolyse et gluconéogenèse ne peuvent coexister.

 

 

L’inhibition allostérique par le fructose_2,6 diè est due à :

-          L’inhibition compétitive par rapport au substrat (analogie avec le fructose_1,6 diè)

-          L’induction d’une coopérative négative pour la fixation du substrat,

-          Le renforcement de l’inhibition induite par l’AMP, par augmentation de l’affinité pour l’AMP :

"  Le fructose_2,6è agit comme un effecteur allostérique hétérotrope

 

                               Vitesse            

                          Vmax

                                                        – fructose_2,6 diè

 

 

                                                          + fructose_2,6 diè

                                                                                         [AMP]

 

-          La fragilisation (avec l’AMP) de la liaison protéine–métaux (MN2+ et Zn2+) dans les sites catalytiques, créant une baisse d’activité.

 

 

Régulation indirecte par l’AMPc de la fructose_1,6 diphosphatase :

 

 

                               Adrénaline                                                     Glucagon

 

( [AMPc]

Phosphorylation de la PFK2

( [Fructose_2,6 diè]

Restauration de l’activité du fructose_1,6 diphosphatase

Baisse de la glycolyse

&

Augmentation de la glyconéogenèse

 

Ø  La glucose–6 phosphatase :

§  Structure de l’enzyme :

 

L’une des principales fonctions hépatiques est la fourniture de glucose.

 

La glucose_6 phosphatase joue un rôle essentiel dans l’homéostasie glucidique car :

                               Gluconéogenèse

                                                                              Glucose_6è

                               Glycogénolyse

 

Le glucose_6 è doit être hydrolysé par la glucose_6 phosphatase pour être libéré dans la circulation.

 

§  Localisation intracellulaire de la glucose–6 phosphatase :

 

Il y a un subfractionnement cellulaire : elle est associée au RE. C’est un caractère la distinguant de la plupart des phosphatases qui sont plutôt cytosoliques.

 

Ses propriétés dépendent de l’intégrité des membranes des lysosomes (majoritairement de RE) :

-          Microsomes intacts   "  Activité phosphatasique 10 fois plus élevée avec le glycose_6è qu’avec le mannose_6è,

-          Traitement des microsomes par des détergents   "  Activité phosphatasique identique mais qui porte une spécificité au glycose.

"  La glucose_6 phosphatase isolée serait une phosphatase relativement non spécifique.

 

Þ  Sa spécifique vis–à–vis du glucose dans la cellule est due à sa localisation subcellulaire.

 

Complexe multienzymatique :

.Poly p 13.

Le complexe est constitué par T1, T2 et T3.

Il sert à la déphosphorylation du glucose.

GLUT_2 se charge de la libération du glucose.

 

 

v Régulation de la synthèse des enzymes clés de la néoglucogenèse :

Ø  Régulation à court terme de la glucose–6 phosphatase :

 

Le Km vis–à–vis du glucose_6è vaut 2 à 3 mM, soit une valeur supérieure aux concentrations intracellulaires (0,05 à 1 mM)

 

"  L’action de l’enzyme va dépendre essentiellement de la concentration en substrat.

 

Le glucose :

C’est l’inhibiteur compétitif in vitro, mais le Ki = 0,1 M (bien inférieur à la glycémie)

                   "  Importance physiologique mineure ?

Le Pi :

C’est l’inhibiteur non compétitif dans le cas des microsomes intacts, et un inhibiteur compétitif dans le cas d’ajout de détergents.

 

"  Divergence interprétée comme indicateur de la présence d’un transporteur de Pi dans les microsomes.

 

 

§  Régulation allostérique de la glucose–6 phosphatase :

 

L’inhibition se fait par le fructose_1è, mais sa concentration physiologique est faible et n’entraîne qu’une petite inhibition.

Elle se fait aussi par l’a_cétoglutarate et les AG :

-          Tous les acyl_CoA                        "  Inhibition de la glucose_6 phosphatase,

-          Les AG insaturés (arachidonate)  "  Aussi inhibition,

-          Les AG saturés      "  Pas d’effet.

 

Il y a des effets inhibiteurs pour des concentrations faibles, mais ces effets sont nuls, voire activateurs, pour des concentrations élevées.

 

 

Ø  Régulation à long terme :

 

Régulation transcriptionnelle coordonnée de la glycolyse et de la gluconéogenèse :

.Poly p 13.

                   "  Régulation hormonale.

 

§  Déficience de l’activité glucose–6 phosphatase :

 

Une telle déficience entraîne la maladie de Von Gierke, ou Glycogen Storage Disease (GSD) de type 1.

 

-         

Dues à l’accumulation de glycogène

 
Hépatomégalie

-          Néphromégalie

-          Hypoglycémie

-          Acidose lactique

 

La GSDI a (80% des cas)    "  Mutations du gène codant pour la glucose_6 phosphatase.

La GSDI b             "  La glucose_6 phosphatase mais il y a une mutation du gène codant pour le transporteur du glucose_6è.

 

 

 

Régulation de la pyruvate déshydrogénase

 

v Rappels de la réaction :

 

Les 5 réactions du complexe multienzymatique de la PDH :

.Poly p 14.

La PDH est une des cibles des composés à base d’arsénic, qui cause la séquestration de la lipoamide et ainsi l’inactivation de la PDH mais aussi de l’a_cétoglutarate déshydrogénase (autre enzyme à lipoamide)

 

Chez les bactéries, ces enzymes ont une localisation cytosolique, ce qui les rend plus sensibles aux arséniates que les enzymes humaines.

"  Les arséniates ont été utilisés comme « antibiotiques » au 19ème siècle. Ils sont rapidement abandonnés en raison des effets  secondaires.

 

 

v Organisation structurale du complexe PDH d’E. coli :

PM = 4600 kDa.

-          E2 : 24 sous–unités associées en trimères localisés au coin d’un cube ;

-          E1 : 24 sous–unités PDH formant des dimères disposés au centre de chacune des arêtes du cube ;

-          E3 : 12 sous–unités de dihydrolypoyl déshydrogénase formant des dimères disposés au centre de chacune des 6 faces.

 

Complexe multienzymatique PDH  d’eucaryote :

-          30 dimères E1,

-          6 dimères E3,

Þ  Ils entourent un noyau central de 60 monomères E2.

 

Ø  Intérêt des complexes multienzymatiques :

 

Ils permettent l’accroissement de l’efficacité catalytique car :

j La distance que doivent parcourir les substrats entre les sites actifs est minimisée.

Augmentation de la vitesse de réaction.

 

k Les intermédiaires métaboliques sont guidés d’une enzyme à l’autre (évitant aussi qu’ils soient utilisés dans des réactions annexes)

 

l Les réactions catalysées par ces complexes multienzymatiques peuvent être régulées de façon coordonnée.

 

v Régulation de la PDH :

Ø  Régulation allostérique :