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Méthodes d’étude de la cellule eucaryote

 

v La microscopie : Méthode d’étude morphologique et d’investigation fonctionnelle :

Ø  Rappels :

 

La microscopie est une méthode morphologique et d’investigation fonctionnelle. L’observation est restreinte aux objets laissant passer :

-          La lumière pour la microscopie photonique :

-         Cellules vivantes (1 à quelques couches),

-          Coupes fines de tissu : 5 à 10 µm.

-          Les électrons pour la microscopie électronique à transmission :

-         Coupes ultrafines : 50 à 100 nm de tissu,

-         Objet entier : virus isolés, macromolécules isolées.

 

L’observation d’objets entiers :

-          Lumière réfléchie (loupe binoculaire = appareil stéréostopique) : objets vivants ou fixés,

-          Electrons réfléchis (microscopie à balayage ou SEM en anglais) : objets entiers fixés.

 

Ø  Limite de résolution d’un microscope :

 

Elle est liée aux phénomènes de diffraction de la lumière ou des électrons :

 


                                                      n : indice de réfraction 

 

                                                      a : moitié de l’angle d’ouverture de la lentille de l’objectif

                                                      l : longueur d’onde

 

L’huile d’immersion a un indice de réfraction supérieur à 1, d diminue donc.

 

La microscopie optique utilise la lumière visible :  400 < l < 800 nm.

Pour la microscopie électronique à transmission, l est associée aux électrons en mouvement.

 


                                                                  V : potentiel appliqué pour l’accélération des électrons

 

 

Dans le meilleur des cas :

Pour la microscopie optique :            d » 2 µm

Pour la microscopie électronique :     d » 1 nm

 

Plus d est faible, plus on peut observer d’objets proches entre eux.

Cf. poly : microscopie photonique / microscopie électronique à transmission

 

Le microscope photonique utilise des lentilles de verre ; alors que le microscope électronique à transmission utilise des lentilles électromagnétiques.

Cf. poly : microscopie classique (à fond clair) / microscopie à contraste de phase et d’interférence différentiel

 

La microscopie à fond clair nécessite souvent une coloration. La microscopie à contraste permet l’observation vitale de cellule en culture (monocouche)

 

La méthode morphologique permet de tissu en microscopique optique et microscopie électronique à transmission.

 

v Méthodes morphologiques :

Ø  Fixation du tissu :

 

Elle se fait avec un mélange d’acide – éthanol (dénaturation et précipitation des protéines) et d’aldéhyde (fixation)

Microscopie optique :     Acide acétique  +  Formaldéhyde

Microscopie électronique à transmission :     Tétroxyde d’osmium  +  Glutaraldéhyde

Le glutaraldéhyde réagit avec 2 fonctions amides de protéines. Il y a la formation de réseaux inter–protéines qui emprisonnent les autres macromolécules, permettant la conservation de la structure cellulaire.

 

Ø  Inclusion et confection de coupes :

 

L’objectif est de solidifier le tissu fixé pour réaliser des coupes fines et régulières.

-          Pour la microscopie optique, l’inclusion se fait dans la paraffine.

-          Pour la microscopie électronique à transmission, l’inclusion se fait dans de la résine (Epon)

Ces produits sont hydrophobes (miscibles dans les hydrocarbures) Il est donc nécessaire de faire une déshydratation préalable avec de l’éthanol qui a cet avantage d’être miscible dans l’eau mais aussi dans les hydrocarbures.

 

Milieu aqueux  "  Ethanol à 70%  "  Ethanol à 95%  "  Ethanol à 100%  "  Xylène ou Toluène

                                                                                                                    = hydrocarbures (2 bains)

Puis :    – Soit de la paraffine à 65°C (liquide)   "  Durcissement à température ambiante

        – Soit de la résine liquide   "  Polymérisation à chaud.

 

Confection des coupes :

 

-          Pour la microscopie optique, on utilise un microtome (rasoir) pour obtenir des coupes sériées de 5 à 10 µm que l’on récupère à l’aide d’un pinceau.

-          Pour la microscopie électronique à transmission, on utilise un ultramicrotome (diamant taillé) pour obtenir des coupes que l’on récupère dans une « piscine » par le biais d’un éclairage oblique (irisation des coupes comme une trace d’hydrocarbure dans une flaque d’eau) et que l’on « pêche » au pinceau.

Les coupes sont ensuite déposées sur une grille de cuivre ou d’or.

 

Ø  Coloration – contraste :

 

-          Pour la microscopie optique, on utilise la coloration.

"   Absorption de certaines longueurs d’onde de la lumière par un groupement chromophore (phore = qui génère) Le chromophore est un groupement moléculaire constitué de doubles liaisons conjuguées, de composés aromatiques.

"   Colorants basiques (cations), comme le bleu de toluidine ou l’hématoxyline, qui se fixent sur les molécules du tissu chargées négativement.

"   Colorants acides (anions), comme l’éosine, qui se fixent sur les molécules du tissu chargées positivement.

"   Autres colorants : molécules hydrophobes (comme les lipides) ou intercalant de l’ADN.

-          Pour la microscopie électronique à transmission, on utilise le contraste.

"   Contrastants (cations), comme l’acétate d’uranyl ou l’acétate de plomb, qui se fixent sur les molécules du tissu chargées négativement.

 

Il se pose un problème pour les colorants (MO) : ce sont des molécules hydrophiles.

"  Il faut un déparaffinage et une hydratation :

 

Xylène  "  Ethanol à 100%  "  Ethanol à 90%  "  Ethanol à 70%  "  Eau  "  Solution de colorant    "  Lavages  "  Ethanol à 70%  "  Ethanol à 95%  "  Ethanol à 100%  "  Xylène ou Toluène

 

Pour la microscopie électronique, on garde la résine. On pose le contrastant et on fait des lavages. La tétrodoxine d’osmium réagit surtout avec les phospholipides membranaires, ce qui permet un beau marquage délimitant la cellule (avec un double trait au fort grossissement : marquage sur les surfaces de la membrane)

 

v Etude de surface en microscopie électronique à transmission (MET) :

Ø  Cryofracture et cryodécapage :

Cf. poly

 

Le tissu doit être dur comme un caillou. On donne un coup entraînant une cassure là où c’est le plus fragile :

-          Entre 2 cellules (quand il y en a plusieurs),

-          Ou au sein de la membrane (pour une seule cellule), entre les 2 couches de phospholipides.

 

Puis, le cryodécapage consiste en la sublimation de l’eau à l’endroit de la cassure.

 

 

Ø  Ombrage puis obtention d’une réplique :

 

Cf. poly

 

L’ombrage consiste en la projection de gaz de métal de manière oblique.

La réplique est ensuite obtenue avec la pose d’un film de carbone et la dissolution de l’échantillon biologique.

 

Ø  Observation d’objets entiers en MET :

 

Elle est possible pour peu qu’ils soient de petite taille (quelques dizaines de nm), tels que les virus isolés, les organites isolés, les macromolécules isolées (comme l’ADN)

Il faut un contraste négatif :

 

            Goutte de solution de métaux lourds = phosphotungsate

 

 


                                                              Séchage sous vide

       Grille + film fin de carbone                                                  " Etude de la forme de l’objet

 

v Localisation cytoplasmique de molécules spécifiques :

Ø  Cytochimie :

 

= Utilisation de réactions chimiques sur des coupes histologiques pour mettre en évidence des grandes classes de macromolécules (acide nucléique, polysaccharide, lipide, etc.)

 

Ø  Histoenzymologie – Cytoenzymologie :

 

-          Détection d’enzymes in situ,

-          Réaction enzymatique effectuée sur des coupes de tissus.

 

On utilise des tissus congelés (coupes à congélation réalisées à l’aide d’un cryostat) On incube les coupes de tissus avec une substance spécifique S générant un produit P qui précipite et qui est soit coloré (MO), soit opaque aux électrons (MET)

Cf. poly : Détection de la phosphatase acide : enzyme spécifique des lysosomes

 

La phosphatase permet de différencier les lysosomes des autres vésicules qui leur ressemblent comme les peroxysomes.

 

Ø  Immunohistochimie – immunocytochimie :

 

Elle consiste à détecter sur des coupes de tissu ou des cellules entières (préalablement fixées et perméabilisées) un antigène cellulaire spécifique à l’aide d’un antisérum (= anticorps) dirigé contre cet antigène.

Cf. poly : Obtention d’un anticorps spécifique

 

Le déterminant antigénique est appelé épitote. Il s’agit d’une protéine reconnue par l’anticorps.

Le plasma correspond au sérum pourvu des protéines permettant la coagulation.

Sang    "  Centrifugation  "     Plasma

Sang    "  Coagulation  "     Sérum

 

Un peptide n’est pas immunogène en soi : il faut le coupler à une grosse protéine (= protéine porteuse)

Cf. poly : Détection d’une protéine par immunocytochimie

 

On préfère la méthode indirecte à la méthode directe. En effet, la méthode directe est moins sensible. La méthode indirecte permet d’amplifier le signal.

Un autre avantage est que l’anticorps IIAIRE marqué fonctionne sur toutes les immunoglobulines du lapin. C’est pratique pour les préparations quand on sait que le couplage d’une protéine à une autre molécule est une réaction chimique complexe et que la protéine est fragile à différents traitements.

 

Un lavage après l’ajout et l’incubation de chaque anticorps est nécessaire pour éviter les liaisons non spécifiques.

 

-          Le fluorochrome est une molécule qui absorbe une longueur d’onde (souvent dans les UV) et restitue une partie de l’énergie absorbée sous forme d’une autre longueur d’onde (souvent dans le visible)

E1 = h.n1 = h . c/l1         "    Fluorochrome    "         E2 = h.n 2 = h . c/l2

 

            E1  >  E2       Þ        l1  <  l2

 

-          Une enzyme peut être utilisée en MO et en MET.

-          Les particules d’or colloïdal présentent une masse atomique qui a tendance à être opaque aux électrons (utilisation en MET)

 

§  Immunofluorescence :

 

Cf. poly : Microscope à fluorescence (ou épifluorescnce)

 

Cf. poly : Microscopie confocale à balayage laser

 

Le faisceau lumineux (laser) balaie la surface de l’échantillon. La lumière réfléchie ou émise (fluorescence) provenant de chaque point de la surface balayée est recueillie par un détecteur, numérisée et stockée dans la mémoire de l’ordinateur.

Seuls les rayons–image venant du plan focal (qui est confocal avec le plan du pinhole = trou d’aiguille) parviennent au détecteur. Cela permet une galerie de sections optiques qui permettent de construire une image 3D. et l’élimination du signal fluorescent provenant d’autres plans.

 

Ø  Hybridation in situ :

 

Elle consiste à détecter sur des coupes de tissu ou des cellules entières (préalablement fixées et perméabilisées) des ARNM spécifiques avec une sonde nucléique complémentaire marquée radioactivement (= oligonucléotide antisens)

 

-          Sonde radioactive  "  Détection par autoradiographie,

-          Sonde fluorescente  "  Détection au microscope à fluorescence (avec un microscope confocal)

 

Cf. poly : Sondes marquées

 

La sonde est une séquence d’ADN. Une sonde antisens va s’hybrider alors qu’une sonde sens ne présentera pas d’hybridation spécifique (= témoin négatif nécessaire)

 

Pour marquer radioactivement une sonde, on utilise de l’ATP marqué au 32P en position g et une oligonucléotide–kinase qui transfert ce phosphate radioactif vers un oligonucléotide :

 

Lame + coupes sériées de tissu déparaffinés et réhydratés

$

Ajout de la sonde et de tampon salin d’hybridation

$

Incubation à 50–65°C (selon la longueur de la sonde)

" Environ la température de fusion de la sonde

$

Lavages à la même température

Pour enlever tout ce n’est pas lié de manière spécifique


$

Soit une autoradiographie

 

 

$

Soit une observation au microscope à épifluorescence (ou confocal)

$

Soit une réaction immunochimique


 

§  Autoradiographie :

 

Cette technique permet la détection de molécules radioactives. Si on incube un tissu ou des cellules en culture avec :

-          De la leucine tritiée (3H–Leu) :

Les protéines synthétisées pendant l’incubation sont radioactives suite à l’incorporation de la leucine tritiée.

Pourquoi la leucine ? Parce qu’elle est retrouvée dans toutes les protéines et qu’elle est peu métabolisée (contrairement à la glycine qui est un glucoformateur)

 

-          De la désoxythymidine tritiée :

L’ADN synthétisée pendant l’incubation est radioactive.

Pourquoi la désoxythimidine ? Parce qu’elle est retrouvée dans toutes les protéines et qu’elle est peu métabolisée (contrairement à l’adénosine qui peut être transfomée pour l’ARN)

 

-          De l’uridine tritiée :

Les ARN synthétisés pendant l’incubation sont radioactifs.

 

-          Des oses tritiés :

Les polyosides ou les oligosaccharides synthétisés pendant l’incubation sont radioactifs (mais pas de glucose tritié parce qu’il est trop métabolisable)

 

Tissu  " Incubation" Fixation" Déshydratation" Inclusion" Coupe" déparaffinage

Zone de Texte: Dans le noir complet
$

  Révélation et observation! Exposition! Lame recouverte

d’une fine couche d’émulsion photo

 

 

 

v Le microscope électronique à balayage (MEB) :

(= SEM en anglais)

Il permet d’étudier :

-          La surface d’objets fixés entiers,

-         La structure 3D de ces objets.

Il repose sur l’analyse des électrons réfléchis à partir d’objets fixés, déshydratés et recouverts d’un film fin de métal lourd (dans le vide)

Cf. poly : le MEB

 

v Fractionnement subcellulaire et cellulaire :

Ø  Fractionnement subcellulaire :

Cf. poly : j Homogénéisation

 

Cf. poly : k (Ultra)centrifugation différentielle

 

Cf. poly : l Ultracentrifugation sur gradient de saccharose

 

Cf. poly : Formation du gradient de saccharose

 

Ø  Fractionnement cellulaire :

 

j Dissociation du tissu :

Dans un milieu isotonique

-          Incubation en présence de protéases (qui hydrolysent les protéines des jonctions intercellulaires)

-          Incubation dans un tampon en présence de chélateurs de Ca2+ (EDTA)

 

k Centrifugation de la suspension cellulaire sur un gradient préformé de Percoll* :

Les cellules sédimentent en fonction de leur densité.

 

v Culture cellulaire :

 

Il faut tout d’abord une dissociation des cellules à partir d’un tissu :

-          Soit avec un traitement par des enzymes protéolytiques (pronase, collagénase, trypsine),

-          Soit avec un traitement par un tampon en présence d’EDTA.

 

Puis, on effectue des lavages par centrifugation. La suspension est ensuite déposée sur des boîtes de culture. Si ce milieu de culture est adéquat, les cellules s’attachent au plastique et se divisent.

= Culture IAIRE

(de fibroblastes, de cellules épithéliales, etc. de vertébrés.

Pour les invertébrés, on n’y arrive que chez la drosophile)

 

A confluence, on peut détacher des cellules (traitement à la tripsine) et le répliquer à moindre densité.

= Culture IIAIRE

NB :  On peut réaliser ce processus un nombre de fois fini (50 à 100 fois)

 

Au cours de la culture, quelques cellules (altérées) acquièrent une capacité à se diviser rapidement, et une capacité de se répliquer de manière non limitée.

= Lignée cellulaire

(Cellules néoblastes, cellules cancéreuses,

cellules transformées par un oncogène, cellules souches)

 

Une lignée cellulaire constitue une source homogène de cellules. Elle permet :

-          L’étude de la réponse cellulaire aux signaux extracellulaires (hormones, facteurs de croissance) au niveau de :

-         La prolifération cellulaire,

-         La synthèse protéique,

-         Le transport cellulaire,

-         La sécrétion de protéines.

-          L’étude des mécanismes moléculaires de transduction du signal extracellulaire (manière dont la cellule intègre et traduit ces signaux) :

-         Voie de signalisation,

-         Acteurs moléculaires mis en jeu.

 

Ø  Milieu de culture :

 

Il doit être stérile, présenter une osmolarité et un pH compatibles ainsi que des ions inorganiques et des métabolites essentiels au métabolisme cellulaire.

 

Exemple :

-          Tampon (Hepes), pH 7,2,

-          Ions NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3

-          Métabolites : glucose (10mM), acides aminés, vitamines, etc.

-          10% de sérum de veau fœtal (pour la présence de facteurs de croissance),

-          Rouge neutre (indicateur de pH),

-          Antibiotiques et antifongiques.

 

Les cultures se font dans un atmosphère stérile, humide, avec 5% de CO2 et 37°C (pour les mammifères)

 

Exemple :

Cf. poly : Mesure de la prolifération cellulaire induite par un facteur de croissance (2pages)

 

On peut également étudier l’effet du facteur de croissance sur :

-          La synthèse protéique totale : étude de l’incorporation de leucine tritiée (même protocole),

-          La synthèse d’une protéine particulière : électrophorèse de l’extrait cellulaire, puis « Western blotting » et détection par un anticorps spécifique et autoradiographie

-          La transcription d’un gène particulier : extraction des ARN, électrophorèse, « Northern blotting », hybridation avec une sonde spécifique et autoradiographie.

 

Cf. poly : Western blotting et Northern blotting

 

v Introduction de molécules dans les cellules vivantes :

 

(Molécules pour lesquels la membrane plasmique n’est pas perméable)

 

j Micro–injection à l’aide d’une micropipette :

 

" Injection d’ADN, d’anticorps, de fluorochromes (quelques mL)

       Elle nécessite un appareillage particulier et une adresse de manipulation.

 

k Electroporation :

 

Les cellules, dans une solution (avec le moins de sels possibles) contenant la molécule à transférer, sont placées dans une cuvette au niveau de laquelle un bref choc électrique est appliqué (décharge de condensateur)

-          Formation de pores transitoires dans les membranes plasmiques,

-          Entrée de la molécule dans la cellule,

-          La membrane se reforme.

 

l Lipofection :

 

Il s’agit de la formation de vésicules (phospholipides) ou de peptides capables de contenir ou de s’associer avec les molécules à transférer.

En présence de cellules, ces composants s’associent aux membranes plasmiques, puis fusionnent et délivrent les molécules à l’intérieur de la cellule.

 

m Bombardement :

 

Des particules s’or recouvertes de l’ADN à transférer sont bombardées vers les cellules. Les particules et l’ADN sont ainsi introduites dans la cellule.

 

v Applications :

Ø  Transfert d’ADN (plasmide) dans des cellules eucaryotes :

La transfection = introduction d’ADN.

j Construction plasmidique :

Cf. poly : Applications : Construction plasmidique

 

Le vecteur est un élément capable de se répliquer de manière autonome. Le plasmide est un vecteur bactérien.

 

k Production du plasmide :

Cf. poly : Applications : Production du plasmide (2 pages)

 

Cette expérience montre qu’il est possible de produire une protéine dans une cellule eucaryote dès lors que l’on possède son ADNC.

La GFP est une protéine intéressante en biologie cellulaire car sa production peut être suivie aisément dans des cellules vivantes. Elle n’est pas toxique.

 

Si on ajoute des séquences étiquettes ou si on fusionne l’ADNC codant une protéine à l’ADNC de la GFP, celle–ci et envoyée dans le compartiment cellulaire désigné par cette étiquette ou cette protéine.

 

Promoteur / Région transcrite :

 

-          Tout gène chez un eucaryote est de l’ADN double brin : un brin matrice (ou antisens), un brin sens. L’ARN polymérase se sert du brin matrice pour faire un brin complémentaire.

 

-          La région non transcrite se situe en amont de la région transcrite. C’est souvent une région régulatrice (= promoteur) avec la présence de facteurs de transcription. La TATAbox est en position –30 et permet la fixation de l’ARN pol. Il y a une spécificité tissulaire.

 

-          La région transcrite d’un gène de type II génère un ARNM, c’est–à–dire un ARN traduit en protéine.

 

-          La transcription commence au site d’initiation et se termine au site de terminaison. Avant la terminaison, il y a un signal de poly–adénylation.

Elle amène à la création d’un ARN prémessager, coiffé et poly–adénylé. Il est labile, c’est–à–dire qu’il a une durée de vie très courte.

 

-          L’intron est d’une région transcrite du gène mais qui n’est pas conservée au niveau de l’ARN mature. Il est éliminé lors de l’épissage. Il existe un épissage alternatif : une région peut être un intron dans une cellule et un exon dans une autre.

 

-          En ce qui concerne la traduction, il existe une région 5’UTR qui est une région non traduite. Elle est en amont du codon AUG utilisé, qui n’est pas forcément le 1er rencontré. Par contre, le 1er codon STOP rencontré marque la fin de la traduction.

Ces régions servent essentiellement à la stabilité de l’ARN.

 

-          La traduction conduit à la synthèse d’une ribonucléoprotéine qui passe dans le cytosol et donne une protéine (en général, un précurseur protéique) qui va encore subir des modifications post–traductionnelles. Les précurseurs protéiques sont souvent non fonctionnels et leur durée de vie est limitée.

 

-          Pour connaître la séquence du précurseur, il faut connaître la séquence de l’ARNM mature.

 

 

 

ADN génomique  "  Banque d’ADN génomique    Þ  Etude de l’organisation du gène

                                                                                         (nombre d’exons, d’introns, etc.)

 

ARNM  "  Banque d’ADNC pour un tissu

Þ  Etude de la séquence de précurseur de protéine,

Þ  Etude de l’expression du gène correspondant (par Northern Blotting, par hybridation in situ),

Þ  Production de la protéine dans des cellules procaryotes ou eucaryote (protéines recombinantes)

 

 

La majorité des protéines cellulaires sont synthétisées sous forme de protéines précurseurs plus longues par rapport à la protéine mature et fonctionnelle.

Ces séquences supplémentaires, qui sont ensuite clivées, sont généralement des séquences « d’adressage cellulaire » servant à l’adoption d’une structure 3D ou permettant un stockage sous forme de protéines inactives.

 

 

 

 

v Construction d’une banque d’ADNC :

Cf. poly : Construction d’une banque d’ADNC (2 pages)

 

 

 

 

v Clonage d’un ADNC par criblage d’une banque d’ADNC :

Cf. poly : Criblage d’une banque d’ADNC avec un oligonucléotide

 

Elle nécessite de disposer d’une sonde :

-          Soit un ADNC codant une protéine homologue chez une autre espèce (proche d’un point de vue phylogénétique), comme l’ADNC codant la pro–insuline chez le rat pour cribler une banque d’ADNC de pancréas humain.

-          Soit, si on dispose de la séquence partielle de la protéine, un oligonucléotide synthétisé à partir de cette séquence.

-          Soit par une approche PCR, si on dispose de la séquence partielle de fragment peptidique de la protéine.

 

 

Transit intracellulaire :

Tri et adressage

 

v Le transit intracellulaire : les séquences d’adressage :

 

Les protéines doivent avoir une structure 3D adéquat et être localisées dans le bon compartiment cellulaire.

Cf. poly : transport intracellulaire

 

Les protéines nucléaires sont des enzymes impliquées dans la réplication du génome et dans sa transcription. Certaines protéines doivent être transloquées suite à une activité donnée. Certaines font la navette, comme les protéines qui habillent les ARN.

 

Les mitochondries et les plastes sont qualifiées de semi–autonomes car ils ont un génome et de la machinerie permettant la réplication, la transcription et la traduction.

90% des protéines sont codées par des gènes nucléaires. Pour ces protéines, il existe un signal d’adressage qu’elles puissent rejoindre la mitochondrie ou le chloroplaste.

 

De plus, différents compartiments existent :

-          La mitochondrie : la protéine synthétisée peut être destinée à la membrane mitochondriale externe ou interne ou à la matrice ou à l’espace intermembranaire. La protéine, sous forme de précurseur, doit être accompagnée de l’information d’adressage.

-          Le peroxysome : le contenu biochimique renferme des enzymes de type oxydase qui oxydent le substrat en utilisant l’O2. Le peroxysome est impliqué dans l’oxydation de nombreux substrats (détoxication de l’éthanol, etc.) Il est important dans l’oxydation des acides gras.

 

Chez les végétaux :

Ils sont capables de faire des oses à partir des lipides et présentent des glycoxysomes. Le glycolate est un intermédiaire de la photosynthèse et donne du glycoxylate (= carburant pour la mitochondrie)

 

Le peroxysome est l’organe de la photosynthèse. Les enzymes intervenant sont synthétisées dans le hyaloplasme.

D’autres enzymes importantes sont destinées à être sécrétées par la cellule, les protéines membranaires, les protéines du REG, du golgi, des lysosomes. Toutes ces enzymes sont synthétisées sous forme de précurseurs.

 

L’adressage des protéines dans le bon compartiment cellulaire est crucial pour le fonctionnement cellulaire. Les ARN étant traduits dans le hyaloplasme, où se trouvent tous les éléments de la machinerie traductionnelle (ribosomes, ARNT, acides aminés, facteurs de traduction, etc.)

Il y a la nécessité de séquence d’adressage.

L’examen de la comparaison de séquences de divers précurseurs de protéines ayant une même localisation cellulaire a permis de définir les possibles « séquence d’adressage ».

 

Séquences signalisatrices :

Organite cible

Nature de la séquence

Motif d’adressage

Localisation

Présence dans la protéine mature

Noyau

Groupe de 5 acides aminés ou 2 groupes d’acides aminés basiques séparés par ~10 acides aminés

Interne

Oui

Mitochondrie

3 à 5 acides aminés basiques non consécutifs plus souvent Sérine ou Thréonine

N–terminale

Non

Chloroplaste

Pas de motif précis, riche en Sérine, en Thréonine et en acides aminés hydrophobes pourvus en Glutamate et en Aspartate.

N–terminale

Non

Peroxysome

Sérine – Lysine – Leucine

C–terminale

Oui

REG :

Protéines lysosomyales

Protéines sécrétées

Protéines membranaires

Peptide signal variable en taille : 15 à 30 acides aminés et en séquence : 1 ou quelques acides aminés chargés et 6 à 12 acides aminés hydrophobes (important pour la translocation dans la lumière du REG)

N–terminale

Non

 

La séquence d’adressage peut être :

-          Une séquence additionnelle sur le précurseur de la protéine mature,

-          Un motif peptidique intrinsèque dans la protéine mature.

Cf. poly : démonstration expérimentale

 

v Transit noyau–hyaloplasme :

Ø  Le complexe de pore nucléaire :

Cf. poly : pore nucléaire

 

Ø  Mécanisme d’adressage :

Cf. poly : transit noyau–hyaloplasme

 

Il y a 4 protéines différentes :

-          L’inportine a,

-          L’importine b,

-          Un facteur de transport nucléaire,

-          Une protéine G qui se lie au GTP (ou GDP) et qui adopte 2 conformations différentes.

 

Il y a aussi des enzymes :

-          La Ran GAP,

-          Un facteur d’échange de nucléotides = RCC1.

 

Les protéines qui font la navette entre le noyau et le hyaloplasme ont 2 étiquettes. La protéine qui est transportée d’un endroit à un autre est appelée protéine cargo, et présente une séquence de localisation nucléaire (SLN)

Elle est transportée par association des importines a et b via les pores nucléaires. Une fois dans le noyau, il y a dissociation par l’interaction d’une protéine G associée à un GDP qui l’échange avec un GTP. La protéine présente alors une conformation permettant l’association avec l’importine b. L’association de l’importine b permet d’envoyer à nouveau dans le noyau. L’enzyme Ran GAP hydrolyse le GTP en GDP.

 

v Transport vers la mitochondrie :

Cf. poly : transport vers la mitochondrie

 

Il existe une séquence d’adressage au niveau d’une protéine précurseur.

Pour que la protéine traverse des canaux protéiques, elle doit être non conformée. Pour cela, au niveau du hyaloplasme, il y a des liaisons avec des protéines caperons qui aident d’autres protéines à adopter leur conformation 3D. Ces chaperons sont des Heat Shock Cognate (HSC)

 

Les HSP (Heat Shock Protein) servent à empêcher la dégradation des protéines. Elles ne sont pas régulées en cas de stress. Elles se fixent à la protéine synthétisée et l’empêchent d’être conformée de manière 3D.

 

Les MSF (Mitochondrial import Stimulation Factor) conduisent à envoyer la protéine à la mitochondrie. Il existe un récepteur mitochondrial qui peut interagir avec le MSF ou avec la séquence initialisatrice, il s’agit du TOM (Transport outler membrane)

 

Une protéine canal, le translocon, assure le transfert de la protéine mitochondriale dans la matrice car il existe des sites de contact entre les membranes interne et externe via ces translocons.

 

Arrivée dans la matrice, la séquence étiquette est clivée par une protéase. La HSC se colle à la protéine puis se détache pour que la protéine ait sa conformation 3D fonctionnelle.

 

Transport vers les membranes mitochondriales :

-          Vers la membrane interne : Il y a un transport dans la matrice puis le mécanisme d’intégration est inconnu.

-          Vers la membrane externe : Il y a une séquence étiquette de la matrice qui ne sera pas clivée en position N–terminale.

 

 

Transport vers l’espace intermembranaire des mitochondries :

Cf. poly : transport vers l’espace intermembranaire

 

Le transfert dans la matrice se fait comme celui des protéines matricielles.

Soit la protéine est complètement transférée et intégrée dans l’espace intermembranaire, soit il y a un blocage du transfert entraînant une intégration dans la bicouche et une coupure pour libérer la protéine.

 

v Transport vers les peroxysomes :

Cf. poly : transport vers le peroxysome

 

Il y a la présence d’une étiquette C–terminale dont le motif est sérine–lysine–leucine (S–K–L)

La catalase est composée de 4 sous–unités avec un atome de fer mais sans hème.

Un récepteur au niveau de la membrane du peroxysome permet l’entrée du complexe au niveau de la lumière du peroxysome. Puis le récepteur retourne dans le hyaloplasme.

 

 

Le système excréteur de la cellule

 

v Rappel – généralités :

Ø  Expérience de Pulse Chase :

 

Le REG, l’appareil de Golgi et les vésicules de sécrétion ont un rôle dans la synthèse et la sécrétion des protéines.

 

L’expérience est réalisée sur des pancréas exocrine de mammifères. Si on incube des fragments de pancréas sur un milieu de culture avec de la leucine tritiée. Les protéines synthétisées sont radioactives suite à l’incorporation.

Le pulse chase nécessite un marquage court car on veut montrer le transport des protéines au cours du temps.

On transfert ensuite des fragments d’organes dans un même milieu de culture contenant en excès de la leucine non radioactive. Cela permet de noyer complètement la leucine tritiée résiduelle non incorporées.

 

Pendant le chase, les protéines nouvellement synthétisées ne sont plus radioactives. Seules sont radioactives les protéines qui ont été synthétisées pendant le pulse.

 

On prélève un fragment de tissu après 30 à 60 minutes de chase dans un milieu de fixation, on effectue des coupes sur lesquelles on pratique une autoradiographie.

" On localise la radioactivité et donc le parcours de cette radioactivité au cours du temps.

 

Les protéines destinées à être excrétées sont synthétisées au niveau du REG, sont transportées dans le golgi puis au niveau des vésicules de sécrétion.

 

Il existe 2 voies de sécrétion dans une cellule dont la sécrétion constitutive (= sécrétion continue de protéines) que l’on retrouve dans :

-          Les hépatocytes qui sécrètent de manière continue de l’albumine, des lipoprotéines, etc.

-          L’intestin qui sécrètent des lipoprotéines.

-          Les lymphocytes B (= plasmocytes différenciés dans la sécrétion d’immunoglobulines)

-          Les fibroblastes.

-          Les cellules du foie qui sécrètent les protéines de la MEC comme le collagène, le protéoglycane, la fibronectine (= macromolécules constituant l’environnement des espaces intercellulaires chez les animaux)

 

La synthèse continue constitue :

-          Un réservoir pour les hormones et les facteurs de différenciation,

-          Un trayage protéique nécessaire à la migration cellulaire,

-          Cohésion entre les cellules,

-          Sécrétion régulée (par exocytose de vésicules de sécrétion déclenchée par un stimulus extracellulaire)

Sécrétion de protéines ou de peptides :

-          Les cellules a et b des îlots de langerhans (pancréas), la neurohypophyse sécrétant de l’oxytocyne, la prolactine, la LH et la FSH (neurohormones)

-          Les cellules exocrines du pancréas (cellules acineuses sécrétant les enzymes digestives, suite à un stimulus de nature hormonale)

-          Les cellules trypsinogènes et chymotrypsinogènes,

-          Les cellules de glandes mammaires qui sécrètent la caséine, la lactalbumine.

 

Les levures :

Ce sont des cellules primitives qui se manipulent comme les bactéries. Il existe un certain nombre de mutants thermosensibles déficients pour la sécrétion des protéines. Ces mutants sécrètent les protéines selon la température du milieu de culture.

 

Ils sont fonctionnels à une température permissive et non fonctionnels à une température non permissive :

-          S’ils sont cultivés à une température permissive, il y a une croissance normale.

-          S’ils sont cultivés à une température permissive, il y a un arrêt de la croissance.

 

-          Pour certains mutants, les protéines sont synthétisées au niveau du hyaloplasme et sont transportées dans le REG.

-          Pour d’autres, les protéines sont synthétisées au niveau du REG.

-          D’autres accumulent des protéines au niveau des vésicules de transition entre le REG et le golgi. Ces mutants présentent une déficience s’ils sont dans l’incapacité de fusionner les vésicules de transition avec les sacs golgiens.

-          D’autres accumulent des protéines au niveau du golgi. Ces mutants présentent une déficience s’il y a absence de transfert entre le golgi et les vésicules de sécrétion.

 

"  Ces différents mutants permettent de décortiquer les mécanismes moléculaires impliqués la sécrétion de protéines dans une cellule.

 

Ø  Clonage par complémentation (chez la levure) :

 

Il y a la construction d’une banque d’ADNC de levure fonctionnelle dans un plasmide d’expression chez la levure.

 

Il s’agit d’un plasmide avec :

-          Un promoteur qui permet la transcription du gène,

-          Un site de clonage pour l’insertion,

-          Une origine de réplication (ORI),

-          Un gène de résistance à l’ampicilline pour la production de beaucoup de protéines dans les bactéries (mais dans une cellule de levure, il se répliquera en même temps que la levure),

-          Un marqueur de sélection de levure : une enzyme permettant la synthèse d’acides aminés. Leu2 code une enzyme permettant à la levure de pousser sur un milieu de culture dépourvue de leucine.

Cf. poly : plasmide d’expression de levure

 

Si les levures accumulent les protéines au niveau du REG,

quel gène empêche le transfert ?

 

Jamais 2 molécules de plasmides n’entrent dans la cellule. Seule une molécule sur 1000 est transformée.

 

De la boîte mère, on réplique 2 boîtes sans leucine : une boîte à 30°C (température permissive), l’autre à 37°C (température non permissive)

Si les levures poussent : la mutation n’existe plus.

Cf. poly : transformation, répliques et croissance

 

Si la mutation des levures établit un blocage de croissance et la protéine lève la mutation, alors cette protéine est impliquée dans le transfert. On effectue un séquençage du gène pour identifier cette protéine.

 

Ø  Synthèse des protéines membranaires :

 

Pulse chase :

" Isolement des différents organites cellulaires,

" Incubation des extraits d’organites en présence anticorps,

" Comptage de la radioactivité associée au culot.

 

Conclusion :

La radioactivité spécifique est maximale dans la fraction « REG » puis dans la fraction « appareil de golgi » puis dans la fraction « membrane plasmique ».

 

Ø  Structure des membranes biologiques :

 

Les protéines transmembranaires :

Avec un ou plusieurs domaines transmembranaires.

D Il faut faire l’orientation de la membrane : la lumière du RE correspond à l’extérieur de la cellule et le cytoplasme correspond à l’intérieur de la cellule.

 

La protéine possède une orientation N et C–terminale. Elle peut être N–terminale au domaine extérieur et C–terminale au domaine intérieur, ou l’inverse.

Cf. poly : protéines transmembranaires et périphériques

 

 

Les protéines périphériques :

Elles sont attachées à la membrane via une liaison avec un lipide. Seuls les domaines en contact avec le milieu extérieur être glycosylés.

Cf. poly : protéines transmembranaires et périphériques

 

Exemple :

Les GLUT sont des protéines à 7 domaines transmembranaires et sont les récepteurs de la majorité des hormones.

Cf. poly : protéines périphériques

 

-          La liaison co–traductionnelle se fait en même temps que la synthèse des protéines.

-          La liaison post–traductionnelle se fait quand la protéine est synthétisée.

 

Le flip–flop correspond au transfert d’un feuillet à l’autre.

 

Schéma général du transfert des protéines :

REG  "  Golgi  "  Vésicule  (l’inverse = transport rétrograde)

Il n’y a jamais de changement de la polarité physique de la membrane.

Cf. poly : schéma général

 

Cis–Golgi réticulum  "  Cis–Golgi  "  Golgi médian  "  Golgi médian "  Trans–Golgi réticulum

Le trans–Golgi réticulum génère des vésicules qui fusionnent avec la membrane plasmique.

Cf. poly : transport antérograde dans le golgi

 

Le transport rétrograde sert à rapatrier les protéines qui sont allées trop loin dans leur cheminement.

 

v Le REG :

Ø  Transfert des protéines de la lumière du REG :

 


Traduction in vitro

(extrait cytosolique)

$

Ajout de microsomes

$

Absence de transfert

Le peptide signal n’est pas clivé

Traduction in vitro

(extrait cytosolique+microsomes)

d’un ARNM codant une protéine sécrétée

$

Transfert et clivage du peptide signal


 

Þ  Mécanisme co–traductionnel

 

Cf. poly : traduction et SRP

Protéine destinée à être sécrétée

 

-          La SRP (Signal recognition particule) est une protéine G car elle peut s’associer au GDP ou au GTP.

-          La fixation de la protéine HSC 70 est nécessaire pour avoir une conformation fonctionnelle.

-          Il y a la présence d’un oligosaccharide : pendant le transfert, un autre mécanisme se réalise : la glycosylation.

 

Ø  Insertion membranaire des protéines :

 

Insertion de protéines à un domaine transmembranaire :

Le système le plus simple est une orientation de la région C–terminale dans le cytosol.

Cf. poly : protéine membranaire à 1 TM

 

Le système le plus complexe est une orientation de la région C–terminale dans la lumière. Il n’y a pas de peptide signal N–terminal, mais il est interne et il est capable de se lier à la SRP selon les mêmes modalités que pour un peptide signal N–terminal.

Cf. poly : protéine membranaire à 1 TM (2ème page)

 

Insertion de protéines à plusieurs domaines transmembranaires :

Il y a des séquences signal interne. Les parties en contact avec la lumière peuvent être glycosylées.

 

Ø  Modification post–traductionnelle et co–traductionnelles :

§  Clivage du peptide signal :

 

Dès son entrée dans la lumière, le peptide signal est clivé par une signal–peptidase, une enzyme associée au translocon.

 

§  Synthèse de l’oligosaccharide sur le dolichol :

Cf. poly

 

Le dolichol est un lipide membranaire. Après flip–flop, le peptide se retrouve coté de la lumière. Grâce à des enzymes membranaires (glycosyltransférases), la partie glycosidique est transférée sur une protéine.

 

§  Transfert de l’oligosaccharide sur la protéine :

Cf. poly

 

Le transfert s’effectue grâce à une glycosyltransférase sur un résidu asparagine. Il s’agit d’une N–glycosylation dont la séquence cible est : Asparagine – X – Sérine/Thréonine.

 

Ne seront glycosylées que les protéines en contact avec la lumière du REG. Les protéines du cytosol ne sont jamais glycosylées (sauf exceptions)

 

§  Hydroxylation :

Cf. poly

 

Elle n’est pas effectuée sur toutes les protéines. Elle est faite notamment sur :

-          L’élastine qui assure une élasticité du tissu conjonctif et qui sont reliées entre elles par des liaisons covalentes, formant un réseau,

-          Le collagène qui est une molécule abondante dans la MEC (matrice extra–cellulaire) et qui est constituée de 3 chaînes qui s’assemblent les unes aux autres liées entre elles.

 

Le procollagène subit des hydroxylations. Le motif GPX est très répété dans le collagène : de nombreux sites d’hydroxylation vont transformer une proline en hydroxyproline.

 

L’hydroxylation ne se fait que dans la lumière du REG. Elle nécessite de l’O2, une hydroxylase, une co–enzyme : la vitamine C et de l’a_cétoglutarate.

 

Puis le procollagène subit une maturation pour devenir le collagène. Cette maturation consiste en la formation de liaisons covalentes par une lysyl–oxydase qui fait des ponts entre les lysines.

 

§  Repliement des protéines :

 

Toute protéine n’ayant pas de structure 3D ne sera pas fonctionnelle. Cela implique les protéines chaperons.

 

Au niveau de la lumière du REG, des enzymes permettant l’oxydation des groupements SH pour permettre la formation de ponts S–S qui consolident la structure 3D mais ces ponts ne sont pas indispensables.

Seules les protéines destinées à être sécrétées auront des ponts S–S car le milieu cytosolique (intérieur de la cellule) est réducteur : les cystéines restent sous la forme SH. La lumière est un milieu oxydé.

Les protéines disulfides isomérases assurent la formation des ponts S–S.

 

Les protéines mal–conformées restent associées aux chaperons et sont retenues au REG puis exportées par le translocon dans le cytosol où elles seront dégradées par le protéasome.

-          Les protéasomes concernent les protéines intracellulaires,

-          Les lysosomes concernent les protéines extracellulaires.

Cf. poly : le protéasome

 

Il s’agit d’un système relativement complexe que l’on trouve dans le cytosol et le nucléoplasme. Il consiste en la dégradation des protéines qui vont subir une ubiquitisation.

Ubiquine = dans toutes les cellules et dont la structure est très conservée.

L’ubiquitine marque les protéines destinées à la dégradation. Ce marquage requiert des enzymes et de l’ATP. Elle se lie au NH2 d’une lysine et non au NH2 terminal.

 

Le protéasome est constitué d’un assemblage de protéines, particules régulatrices. Ces particules reconnaissent l’ubiquitine et renferment des ATPases qui dénaturent les protéines qui sont ensuite envoyées dans la structure centrale qui contient des protéases. Au final, on obtient des petits peptides et de l’ubiquitine. Les peptides sont ensuite dégradés en acides aminés par une peptidase cytosolique ou par une intervention du système immunitaire.

 

v L’appareil de Golgi :

 

C’est un empilement de saccules aplatis. La lumière des saccules correspond à l’extérieur de la cellule. Il y a aussi des vésicules golgiennes qui fusionnent avec les saccules.

Il s’agit d’un organite polarisé qui présente :

-          Une face de formation = le cis–Golgi (là où se forme le golgi),

-          Une face de maturation = le trans–Golgi.

 

Ø  Modification post–traductionnelles dans l’appareil de Golgi :

§  Glycosylations :

·         N–glycosylations :

Cf. poly

 

La glycosyl–transférase élimine 3 mannoses.

 

§  Synthèse de glycolipides :

Cf. poly : système ABO

 

Il est lié à des résidus glucidiques. Il y a une O–glycosylation sur un groupement OH appartenant à une sérine ou une thréonine ou une hydroxyproline. Les O–glycosylations sont faites uniquement dans l’appareil de golgi et de manière séquentielle par ajout d’oses.

Elles sont très variables et concernent la séquence des oses. Ces O–glycosylations débutent dans le cis–Golgi et se terminent dans le trans–Golgi.

 

Le système ABO consiste en une O–glycosylation.

 

§  Phosphorylation des glycoprotéines lysosomiales :

Cf. poly

 

La protéine va dans le lysosome si elle est reconnue par la N–acétylglucosamine transférase. Si elle n’est pas reconnue, elle ne sera pas modifiée par cette enzyme.

La phosphodiestérase permet le clivage du N–acétylglucosaime et la protéine est phosphorylée. Il y a la présence d’un système d’étiquetage.

 

§  Clivages protéolytiques et amidation :

Cf. poly

 

L’arginine est reconnue par la trypsine qui coupe après un acide aminé basique. Les protéases de l’appareil de golgi peuvent être des prohormones convertases.

 

v Les vésicules de sécrétion :

Cf. poly : pyroglutamination

 

La pyroglutamination permet le blocage de certains peptides. Cela concerne les peptides dont le 1er acide aminé est une glutamine. Présente dans les vésicules de sécrétion, une enzyme catalyse la cyclisation de l’acide aminé. Ce peptide cyclisé est le pyroglutamate (pGln)

 

Les vésicules de sécrétion sont les lieux de stockage des produits de sécrétion de la voie régulée.

Pour emballer les produits de sécrétion, il y a la présence de protéines d’emballage : la sérotogranine 1 et la chromogranine. Ce sont des protéines riches en acides aspartiques et en glutamiques (acides aminés chargés négativement) et qui contiennent un complexe de Ca2+.

 

Dans les vésicules, on peut avoir plusieurs produits différents stockés dans la même cellule. On peut aussi rencontrer des neuropeptides.

 

v Les lysosomes :

 

Ils contiennent des enzymes hydrolytiques acides (pH optimal acide) Il faut donc maintenir une acidité grâce à une pompe à protons : ATPase H+.

 

Les hydrolases que renferment les lysosomes sont souvent glycosylées et phosphorylées. Elles peuvent dégrader toutes les macromolécules.

 

v Les compartiments de l’endocytose :

 

Ils proviennent des invaginations de la membrane plasmique au moment de l’endocytose. Ils sont dans le hyaloplasme périphérique (= endosomes précoces)

La dissociation entre le récepteur et le produit de l’endocytose se réalise à cet endroit.

 

Les endosomes tardifs sont près de l’appareil de golgi : lieu de concentration des produits de l’endocytose avant qu’ils ne fusionnent avec un lysosome IAIRE pour donner un lysosome IIAIRE.

 

v Transport, tri et adressage des protéines dans le système sécréteur de la cellule :

 

Pour qu’il y ait communication entre 2 compartiments, il faut qu’il y ait bourgeonnement de la membrane du compartiment donneur, fission par pincement du bourgeonnement, postage et arrivage de la vésicule bourgeonnée au compartiment receveur cible.

 

Approches expérimentales :

-          Utilisation de mutants de levure déficients pour certaines étapes de la sécrétion :

Par clonage, on a pu identifier des protéines cruciales impliquées dans le trafic intracellulaire des protéines. On a pu déterminé les protéines homologues chez les autres cellules eucaryotes les plus évoluées.

-          Etudes biochimiques après la purification de vésicules et de protéines :

" Etude des interactions entre les protéines purifiées.

-          Utilisation des coupes ultrafines en s’intéressant à des cellules endocrines ou exocrines :

On observe un REG développé, un golgi développé et de nombreuses vésicules de tailles différentes, certaines d’entre–elles sont présentes du coté hyaloplasmique avec un aspect opaque, assez dense.

-          Observation de puits recouverts d’un matériau fibreux et dense du coté …

 

Ø  Mécanisme du bourgeonnement :

 

Il résulte d’une interaction entre les protéines membranaires ou luminales du compartiment donneur avec des protéines cytosoliques qui constituent le manteau (aspect dense)

Ces protéines sont responsables de la déformation mécanique de la membrane et, en même temps, elles piègent les protéines à transporter dans le compartiment receveur

= Tri des protéines

 

On ne connaît que 3 types de vésicules recouvertes :

-          Les vésicules « COP I » qui sont impliquées dans le transport rétrograde, c’est–à–dire du trans–golgi vers le cis–golgi et aussi du cytoplasme vers le REG.

-          Les vésicules « COP II » qui assurent le transport antérograde, c’est–à–dire du  REG vers le cis–golgi puis vers le trans–golgi.

-          Les vésicules à clathrine qui sont rencontrées lors de l’endocytose : du golgi vers l’endosome, du golgi vers le lysosome et de la membrane plasmique vers l’endosome précoce.

 

Elles impliquent la polymérisation avec l’interaction de certaines sous–unités du manteau = interaction des protéines adaptateur avec le domaine cytosolique des protéines membranaires du compartiment donneur.

Cela permet la sélection des protéines qui seront transportées.

 

Ce système de polymérisation/dépolymérisation permet la régulation par des enzymes de liaison au GTP. Ces associations au GTP/GDP sont contrôlées par des enzymes cytosoliques : GAP.

§  Vésicules « COP I » des étapes précoces du transport :

 

Dans le manteau, on a déterminé 8 protéines dont 7 COP I (a, b, b, g, d, e, z = cotmère) et une protéine de régulation (= ARF)

Cf. poly : mécanisme de transport

 

La GAP hydrolyse le GTP en GDP. On obtient une molécule lisse qui peut accoster le compartiment accepteur.

 

Au niveau golgien, les vésicules recouvertes de COP I capturent des protéines qui possèdent le motif C–terminal cytoplasmique avec le motif lysine–lysine–X–X.

 

Les protéines qui subissent un transport rétrograde sont les protéines qui résident du REG et qui sont transportées plus ou moins par erreur dans l’appareil de golgi au cours du transport antérograde.

C’est un moyen de rapatrier ces protéines dans le compartiment adéquat.

 

Les protéines luminales du REG ont souvent un motif KDEL (lysine–asparagine–glutamine–leucine) en position C–terminale.

Cf. poly

 

§  Vésicules « COP II » :

 

Elles ont été identifiées chez les levures. On a identifié des mutants.

 

Il y a la formation d’un cotmère comme avec les vésicules COP I. Une protéine G (= SAR) sélectionne un certain nombre de protéines qui peuvent subir le transport, dont la séquence DXE (asparagine–X–glutamate)

Le mécanisme est similaire aux vésicules COP I, mais il permet un transport antérograde.

 

§  Vésicules à clathrine :

 

C’est une protéine fibreuse, un complexe multiprotéique constitué de 3 chaînes lourdes et 2 chaînes légères qui s’assemblent pour former un triskèle.

Cf. poly

 

Quand il y a polymérisation, cela forme un trayage polygonal, c’est–à–dire la formation d’une sorte de cage.

De nombreux complexes protéiques referment un adaptateur (= protéine d’assemblage)

 

La régulation de l’assemblage est assurée par une protéine G (= facteur de type ARF spécialisé pour les clathrines) Cet ARF contrôle la fixation des particules d’assemblage qui vont à leur tour déclencher le phénomène de polymérisation de la clathrine.

Ces particules d’assemblage, en fonction de la protéine adaptateur qu’elles renferment, déterminent la nature des protéines membranaires qui vont être transportées. On distingue 3 types de protéines adaptateurs : AP1, AP2 et AP3.

 

-          Les protéines d’assemblage à AP1 lient les protéines membranaires du trans–golgi et sont destinées aux lysosomes.

-          Les protéines d’assemblage à AP2 lient les protéines de la membrane plasmique au cours de l’endocytose via des motifs qui peuvent être :

-          Tyrosine–X–X–(phenylalanine ou trypsine)

-          Leucine–leucine.

-          Les protéines d’assemblage à AP3 envoient vers les vacuoles (qui correspondent aux lysosomes)

Cf. poly : mécanisme de transport

 

Ø  Accostage et fusion des vésicules au compartiment accepteur :

 

Il y a un échange de GTP au niveau de la protéine.

La vésicule dénudée peut fusionner avec la membrane du compartiment accepteur. Cela implique de nombreuses protéines solubles et membranaires.

-          Les protéines solubles :

-          NSF (N–éthyl Mallemide Sensitive Factor)

-          SNAP (a, b et g)

-          Les protéines membranaires = les SNARES (Soluble NSF Acceptor Receptor)

-          V–SNARES (Vesicular),

-          T–SNARES (Target)

Cf. poly

 

Chaque type de vésicule possède sa propre adresse et chaque membrane cible possède un ou plusieurs T–SNARES complémentaires de V–SNARES spécifiques. Il existe des protéines régulatrices de cette association V et T–SNARES :

-          Le complexe NSF–SNAP,

-          Le N–SEC qui peut se complexer avec le T–SNARE et inhiber l’association de V et T–SNARE.

Cf. poly : fusion des bicouches de phospholipides

 

Les toxines botuliniques ont des effets inhibiteurs sur la libération des neurotransmetteurs. Elles ont pour cible les V et T–SNARES des vésicules synaptiques.

 

 

Ø  Mouvements de vésicules :

Cf. poly : cœur de la zone golgienne

 

Dans une cellule interphasique, les microtubules irradient à partir de la zone COMT, qui est un centre de nucléation.

COMT = Centre Organisateur de MicroTubules, qui renferme de la tubuline.

 

Les microtubules ont une polarité (+/–) et il y a un allongement vers le pôle +.

-          Quand les vésicules vont du REG vers le golgi, elles se déplacent en se guidant sur les microtubules. Il s’agit du transport antérograde (du + vers le –)

-          Quand il s’agit du transport rétrograde, elles se déplacent du – vers le +.

 

Le système moteur est constitué d’une dynéine cytosolique (= complexe dynamique) qui peut se déplacer du + vers le –. Le transport du – vers le + se fait grâce au système de kinésine.

 

Il y a l’existence de microtubules qui interviennent dans des régions pauvres en microtubules (= régions juxtambaires) Dans ce cas, il y a l’intervention d’actine filamenteux (= polymère d’actine globulaire) et de myosine non musculaire (qui a une action ATPasique)

 

 

v Exemple de trafics intracellulaires :

Ø  Transport de protéines lysosomiales vers les lysosomes :

Cf. poly : « adressage » des protéines lysosomiales

 

Ø  Exemple d’endocytose :

Cf. poly

 

Les puits recouverts de clathrine renferment LDL. Il y a formation d’une vésicule qui fusionne avec une vésicule pour former un endosome tardif.

Il y a un recyclage des récepteurs par exocytose.

La particule libre fusionne avec un lysosome IAIRE pour former un lysosome IIAIRE.

L’Apo B est hydrolysé en acides aminés.

Les esters de cholestérol sont hydrolysé en cholestérol et acides gras.

 

Exemple d’endocytose médiée par des récepteurs :

Cf. poly

 

Le complexe apotransferrine–récepteur va être libéré par exocytose. Les récepteurs sont captés car ils possède un motif.

 

Ø  Exemple de fusion membranaire : infection d’une cellule eucaryote par un virus à enveloppe :

Cf. poly : cycle viral

 

Tous les virus possèdent un acide nucléique et un capside. Ceux à enveloppe ont, en plus, une bicouche de phospholipides.

Un virus infecte des cellules via des récepteurs membranaires.

 

Pour les virus à membrane, ils se retrouvent dans une vésicule d’endocytose. Dans cette vésicule, il y a fusion de la membrane de la vésicule et de l’enveloppe du virus. Le génome (ADN ou ARN) du virus se retrouve dans le cytosol.

 

Ces virus à membrane ne conduisent pas toujours à une lyse mais une mort plus ou moins programmée due au détournement du métabolisme.

 

 

Signalisation inter et intra cellulaire

 

v Généralités :

Ø  Contacts intercellulaires :

Cf. poly : contacts intercellulaires

 

Les organismes pluricellulaires doivent percevoir des sources de nourriture uni– ou pluricellulaires, de même les substances ou stimuli physiologiques favorables à leur survie.

Pouvoir communiquer entre les individus permet des stratégies collectives et donc la survie de l’espèce face à des changements d’environnement (par reproduction sexuée la plus souvent)

Il peut avoir la sécrétion de substances chimiques (= phéromones) dans le milieu externe qui permet la communication.

 

Il y a la mise en place de nombreux mécanismes qui assurent la coordination des différentes activités cellulaires.

Les protéines d’adhésion servent aussi de message (dont la CAM) D’autres liaisons sont dépendantes au Ca2+.

 

Ø  Contacts protéines membranaires – matrice extracellulaire :

Cf. poly : contacts protéines membranaires – matrice extracellulaire

 

Les protéines membranaires sont souvent reliées à des protéines du cytosquelette ou à des kinases, etc.

 

Ø  Messagers circulants :

Cf. poly : messagers circulants

 

Il existe différents mécanismes :

-          Sécrétion autocrine (cytokines du système immunitaire) :

La cellule sécrète une protéine (messager) et s’autorégule.

-          Sécrétion paracrine :

Instruction des cellules à proximité qui possède les récepteurs spécifiques (régulation locale)

-          Sécrétion endocrine :

La cellule sécrète son produit qui est disséminé dans l’organisme via la circulation sanguine.

 

Les molécules sécrétées peuvent être des hormones, des facteurs de croissance ou des cytokines. Elles peuvent être aussi :

-          Des acides aminés

-          Des amines biogènes (= dérivés d’acides aminés), comme le GABA (dérivé du glutamate), l’adrénaline, la noradrénaline, l’histamine, la mélatonine.

-          De l’acétylcholine,

-          Des hormones thyroïdiennes,

-          Des lipides (acides gras, stéroïdes, prostaglandine)

-          Certains nucléotides (ATP)

-          Et des protéines (grosses molécules)

 

Les grosses molécules ne peuvent pas traverser la membrane. Les acides aminés, les peptides, les protéines et les glycoprotéines agissent par des récepteurs au niveau de la membrane.

Les molécules hydrophobes peuvent agir via des récepteurs intracellulaires car ils peuvent diffuser au travers de la bicouche (hormones stéroïdes, thyroïdiennes, prostaglandine, NO)

 

v Différentes classes de récepteurs et leurs modalités de transduction du signal :

Ø  Récepteurs canaux activés par des ligands :

§  Récepteurs canal ionique – récepteur nicotinique de l’acétylcholine :

Cf. poly : récepteur nicotinique de l’acétylcholine

 

La liaison du ligand (= messager IAIRE) à son récepteur spécifique déclenche des cascades d’activation (= transduction du signal) et conduit à une réponse cellulaire adaptée (contraction, synthèse d’enzyme, activation d’enzymes et de voies métaboliques, sécrétion de protéines, différenciation cellulaire, prolifération cellulaire, etc.)

 

Il existe 4 grandes familles de récepteurs :

-          Les récepteurs canaux,

-          Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG),

-          Les récepteurs à activité enzymatique intrinsèque ou associée,

-          Les récepteurs intracellulaires à activité facteur de transcription.

 

Le récepteur nicotinique est important au niveau des jonctions neuromusculaires des muscles striés. Le 1er récepteur nicotinique cloné possédait 4 gènes : a, b, g et d. La stoechiométrie du récepteur contient 4 sous–unités différentes mais avec 2 sous–unités a.

La sous–unité a lie le ligand naturel : l’acétylcholine. L’ouverture du canal dépend de la liaison du ligand.

 

Ces 5 sous–unités sont constituées de 4 domaines transmembranaires avec une strucutre en hélice. Ces sous–unités sont constituées sous le même schéma. Elles sont incrustées dans la membrane mais il y a 3 surfaces hydrophobes et 1 hydrophile.

Ces sous–unités s’assemblent pour former un canal.

 

Ce canal est ionique : la face hydrophile se trouve vers le canal.

La liaison de l’acétylcholine provoque un changement de conformation qui est de type coopératif et qui laisse passer des ions Na+–K+. Les ions sont hydratés.

Ce canal sélectionne les ions positifs car 2 zones sont riches en acides aminés acides (chargés négativement) sur les bords du canal.

 

L’ouverture du canal provoque un gradient de Na+ massifs qui entre dans la cellule. Cette dépolarisation membranaire entraîne un changement de conformation des canaux ioniques dépendants du potentiel.

La dépolarisation atteint un niveau tel que les canaux dépendants s’ouvrent entraînant une entrée encore plus massive de Na+ et créant ainsi un potentiel d’action qui se propage (contraction de la cellule)

 

§  Autres récepteurs canaux pentamériques :

 

-          Les récepteurs GABA :

Le GABA est un neuromédiateur qui se fixe sur un récepteur pentamérique, mais c’est un canal Cl, entraînant une hyperpolarisation.

Ces récepteurs sont présents au niveau de l’encéphale.

 

-          Les récepteurs à la glycine :

La glycine est un neuromédiateur identique au GABA. Ces récepteurs sont présents au niveau de la moelle épinière.

 

-          Les récepteurs au glutamate :

Le glutamate est un neuromédiateur excitateur dont le canal pentamérique est un canal Na+ ou un canal NMDA. Ces récepteurs sont situés dans le SNC.

 

Ø  Récepteurs couplés à des protéines G :

 

Ils lient le GTP et sont présents chez tous les eucaryotes. Chez les mammifères, il y a 200 catégories de récepteurs couplés aux protéines G ainsi que les récepteurs olfactifs : un génome de mammifères compte de 800 à 1000 protéines G différentes.

 

§  Structure :

Cf. poly

 

Ce sont des heptamères, donc avec 7 domaines transmembranaires (= hélice a traversant la membrane) La partie N–terminale est extracellulaire. L’extrémité C–terminale est cytoplasmique.

Il y a 3 boucles extracellulaires E1, E2 et E3, 3 boucles intracellulaires I1, I2 et I3 et une pseudoboucle possible.

Il y a la présence de site de N–glycosylation (extracellulaire) et de ponts disulfures entre E1 et E2.

 

 

§  Nature des stimuli :

Cf. poly : Nature des ligands des RCPG

 

-          Le 1er stimulus : les photons

Exemple : la rodopsine est un récepteur particulier, associé de manière permanente à son propre ligand : 11–6 rétinal (dérivé de la vitamine A)

L’activation se fait par absorption des photons qui entraîne un changement de conformation du 11–6 rétinal (conformation Cis en Trans)

 

-          Le 2ème stimulus : les catécholamines et les petits ligands

Exemple : les récepteurs olfactifs, gustatifs, les phéromones aériennes.

Les catécholamines (dont l’adrénaline) sont des neuromédiateurs chimiques abondants dans le SNC. La liaison des ligands se fait au niveau des hélices.

Cela concerne les récepteurs muscariniques, les récepteurs GABA, aux amines biogènes (dopamine, adrénaline, acétylcholine), aux nucléosides, aux nucléotides (ATP), acides aminés, aux lipides, à la progestérone, etc.

 

-          Le 3ème stimulus : les peptides

Exemple : neuropeptides, peptides hormonaux (sang), neuromédiateurs (sécrétés dans les sinapses), peptides exogènes.

Il s’agit des molécules à une liaison peptidique au moins. Ce sont des neuromédiateurs. Ils se fixent en se liant en surface des boucles E1 et E2.

 

-          Le 4ème stimulus : les hormones glycoprotéiques

Exemple : LH, FSH, TSH

Elles sont synthétisées dans l’hypophyse antérieure. Ce sont de grosses molécules qui se lient à la partie extracellulaire en N–terminal.

 

-          Le 5ème stimulus : le glutamate

Il ne se lie pas comme les autres acides aminés. Il se lie en N–terminal.

 

-          Le 6ème stimulus : la thrombine

Elle clive le fibrinogène. En se liant à ses récepteurs, elle clive le récepteur entraînant un changement de conformation du récepteur. La fixation du ligand provoque un changement de conformation du récepteur entraînant des protéines couplées à ce récepteur (protéines G)

Cf. poly : Récepteurs cannabinoïdes

 

§  Activation des protéines G :

Cf. poly

 

Les protéines G sont des protéines G hétérotrimériques associées à la membrane via des lipides (pour les sous–unités a et g) La sous–unité b est juste associée à a et g par des liaisons de faible énergie.

 

La sous–unité a peut lier le GDP ou le GTP. Elle n’a pas la même conformation si elle se lie au GTP ou au GDP.

Þ Ce qui active la protéine G est la réaction d’échange entre le GTP et le GDP. Cette activation provoque du complexe : b et g peuvent interagir avec un effecteur (qui peut être une enzyme, un canal ionique, un transporteur)

Cela peut conduire à la synthèse de messager secondaire.

L’agoniste est le ligand propre du récepteur ou un analogue.

-          La fixation de l’entreprise entraîne un changement de conformation, provoquant une interaction avec la sous–unité a qui change de conformation.

-          L’échange du GDP en GTP entraîne la dissociation en sous–unités bg et a–GTP : l’un et l’autre peut agir avec un effecteur.

-          Le retour aux conditions initiales est dû à une activité GTPasique de la sous–unité a.

 

§  Les différentes classes de protéines G :

Cf. poly

 

§  Variétés des effecteurs cibles de protéines G : transduction du signal :

·         Les adénylates cyclases :

 

L’inhibition se fait sur des adénylates cyclases activées qui produisent de l’AMPC à partir d’ATP. Une adénylate cyclase synthétise plusieurs molécules d’AMPC permettant une amplification du signal.

 

L’ AMPC exerce son activité via des enzymes qui sont des protéines kinases. La protéine kinase A (PKA) possède des sites de liaison pour l’ AMPC, ce qui active la PKA.

Cf. poly : la protéine kinase A

 

La PKA présente 4 sous–unités : 2 sous–unités régulatrices, 2 sous–unités catalytiques.

Sous sa forme inactive, l’augmentation d’ AMPC lui permet de se fixer sur les sous–unités rédulatrices. Le changement de conformation causé consiste en la dissociation du complexe en sous–unités catalytique et en sous–unités régulatrices. La sous–unité catalytique activée phosphoryle ses substrats grâce à l’ATP.

Il existe des sérines–thréonines kinases.

 

Les protéines cibles de la PKA sont les protéines du cytosquelette, les canaux ioniques, les facteurs de transcription (modulation de gènes qui répondent à l’ AMPC.

Cf. poly : cascade d’amplification du signal

 

Cas de l’adrénaline :

Cf. poly

 

L’adrénaline est un acide modifié de la tyrosine. Elle est sécrétée en cas de stress par les surrénales. C’est une hormone qui active l’organisme qui va dépenser plus d’énergie. Elle agit au niveau du foie.

 

Elle a une action via des récepteurs membranaires des cellules hépatiques et des cellules musculaires squelettiques (récepteurs couplés à des protéines GS) qui active l’adénylate cyclase membranaire. Cela entraîne une synthèse d’AMPC activant la PKA qui a pour cible un certain nombre de protéines.

La GPKinase (glycogène phosphatase kinase) inactive devient active sous forme phosphorylée.

Cf. poly : les régions promotrices capables d’activer la transcription présentent des régions CRE (CAMP responsive element)

 

L’action de l’ AMPC peut s’exercer sur des enzymes ou des facteurs de transcription. Une protéine permet la mise en place de l’initiation de la transcription via la formation d’un complexe (avec l’ AMPC) qui permet la transcription.

 

·         La phospholipase C :

 

C’est une enzyme membranaire qui hydrolyse les phospholipides, plus particulièrement les phospho–inositols biphosphate (PIP2)

Cf. poly : la phospholipase C

 

Cf. poly : la voie de l’IP3

 

L’IP3 a des récepteurs membranaires au niveau intracytoplasmique (RE) La fixation de l’IP3 à son récepteur entraîne l’ouverture du canal (des récepteurs canaux) et la sortie de Ca2+ du RE vers le cytoplasme (augmentation transitoire de la concentration intracellulaire en Ca2+)

L’IP3 est un 2nd messager, le Ca2+ est un 3ème messager. Ce dernier va activer un certain nombre d’enzyme :

-          La CAM (= calmodilune) : le complexe calmiduline–Ca2+ active une kinase.

-          La protéine kinase C qui acquiert une affinité et est recrutée par la membrane. La PKC est activée par le diacylglycérol (qui active plusieurs substrats = protéines qui vont être phosphorylées)

Cf. poly : la PKC est dépendante du complexe Ca2+–calmoduline

 

·         La GMPC phosphodiestérase :

 

Dans les cellules de la rétine, la transduction se fait par des protéines GaT (transducine) Elle se couple à la rhodopsine.

Liée au GTP, la GaT active la GMPC phosphodiestérase qui hydrolyse le GMPC en GMP. Cela entraîne une baisse de la concentration en GMPC dans les cellules rétiniennes, provoquant une baisse des molécules de GMPC associées à des canaux cationiques.

Þ La membrane devient transitoirement hyperpolarisée.

 

·         Les canaux ioniques :

 

Dans les cellules à bâtonnet, la concentration en GMPC est importante. Le GMPC se lie à des canaux Ca2+ membranaires.

Certains canaux ioniques à K+ ou Ca2+ sont modulés par des protéines GaI ou encore Ggb.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Ø  Récepteurs à activité enzymatique intrinsèque ou associée :

§  Récepteurs à activité tyrosine–kinase (= TKR) :

 

Les TKR phosphorylent des protéines sur des résidus tyrosines. Les ligands sont des protéines à activité facteur de croissance.

D Les facteurs de croissance ont une activité autocrine ou paracrine.

A ne pas confondre avec les hormones de croissance qui ont une activité endocrine.

 

Exemples :

-          EGF (epidermal growth factor),

-          FGF (fibroblast growth factor) : actif sur la différenciation des fibroblastes en culture,

-          Neurotrophines : elles agissent sur les neurones et les cellules gliales. Elles assurent la plasticité des neurones (nombre de connexions)

-          Insuline : elle agit en tant que TKR.

-          IGF (insulin growth factor) : il présente un domaine transmembranaire unique (hélice a de 21 acides aminés), un domaine intracellulaire unique enzymatique (catalytique) et un domaine NH2 extracellulaire.

 

Le ligand recrute généralement 2 récepteurs qui se phosphorylent mutuellement (autophosphorylation des récepteurs, ou plutôt transphosphorylation), mais phosphorylent aussi d’autres protéines signal (différents de celle de l’insuline)

 

Le domaine de liaison de protéines de signalisation intracellulaire :

Cf. poly : récepteur à domaine tyrosine–kinase

 

Ces protéines sont souvent modulaires : elles possèdent plusieurs domaines d’interaction avec d’autres protéines et peuvent former un réseau 3D.

On distingue :

-          Les domaines SH2 (Src homology domaine 2) et PTB (phosphotyrosine binding) se lient aux protéines phosphorylées au niveau d’un tyrosine localisée dans une séquence spécifique.

-          Le domaine SH3 se lie à des séquences courtes, riches en proline.

-          Le domaine PH (Plekstrin homology) se lie aux groupements chargés de phosphoinositol membranaires spécifiques.

Cf. poly : sur les phosphotyrosines des récepteurs activés, nombreuses protéines peuvent s’ancrer

 

·         Transduction du signal : cas de la voie des MAP kinases :

Cf. poly (3 pages)

 

-          Le GRB2 peut se fixer sur le récepteur phosphorylé, entraînant un changement de conformation. Il possède aussi un domaine SH3, activé par phosphorylation, va pouvoir se fixer à une protéine SOS (= GEF = guanine nucleotid exchange factor)

-          La protéine SOS devient active et va pouvoir recruter Ras (inactive) qui va pouvoir échanger son GTP en GDP.

-          S’il y a hydrolyse du GTP, Ras devient à sont tour active et il y a retour à la voie de départ : SOS et GRB2 s’inactivent.

-          Ras active est recrutée par Raf qui s’active. Raf est une protéine kinase (MAPKKK) qui phosphoryle un substrat particulier : MEK.

-          MEK phosphorylée devient à son tour active. C’est aussi une protéine kinase (MAPKK) qui phosphoryle la MAPK.

-          La MAPK phosphorylée se dimérise et va phosphoryler un certain nombre de protéines spécifique : enzyme, protéines du cytosquelette. Les protéines cibles contiennent des facteurs de transcription.

-          La phosphorylation de ces facteurs provoque la transcription de gènes cibles.

Cf. poly : activation transcriptionnelle induite par les MAP kinases

 

L’activation d’une MAPK conduit à la division cellulaire et à l’activation d’autres protéines. L’activation des gènes cibles entraîne aussi la mitose. Ces gènes possèdent, au niveau de leur promoteur, un élément de réponse SRE (serum response element)

Les SRE sont des éléments de réponse aux facteurs de croissance.

Comment la MAPK peut–elle activer les gènes ?

La MAPK peut phosphoryler des facteurs de transcription (SRF = serum response factro) qui se lie spécifiquement au SRE et qui peuvent agir avec des cofacteurs TCF

SRF et TCR se lient à SRE mais, quand ils sont sous la forme non phosphorylée, ils ne peuvent pas induire la transcription des gènes.

 

Le complexe phosphorylé fait que le complexe d’initiation de la transcription provoque la transcription des gènes.

Si la MAPK phosphoryle pp90RSK, ce dernier peut induire la transcription.

 

Parmi les ligands qui agissent sur les RTK, on trouve le FGF, l’insuline et l’IGF (sécrétés par le foie) :

-          L’insuline est hypoglycémiante. Elle n’active pas uniquement la voie des MAP kinases mais aussi la voie du PIP3.

-          Les IGF n’ont pas de rôle dans la glycémie mais ils ont un rôle de facteur de croissance sur les chondrocytes (cartilage)

 

·         Voie de la PI3K (= phospho–inositol–3–kinase) :

Cf. poly

 

Une fois le récepteur phosphorylé, les protéines recrutées par le récepteur seront, par exemple, la PIK3 (kinase à 2 sous–unités : P110 et P85) P85 a un domaine SH2 et reconnaît donc des protéines ayant des tyrosines phosphorylées.

Le recrutement fait que la kinase se retrouve au niveau de la membrane plasmique. Ses substrats sont les phospho–inositols dont le PI4P et le PI4–5 diP.

 

Il existe des protéines de type PH, capables de se lier aux phospho–inositols 3–4 diè et phospho–inositols 3–4–5 triè.

En phosphorylant les inositols, il leur est possible de se fixer à des protéines du type PH, dont la PKB et la PDK1. Ces enzymes vont devenir actives.

La PKB devient active suite à sa phosphorylation par PDK1. PKB active phosphoryle de nombreuses protéines cibles.

 

L’insuline fait décroître la concentration du glucose sanguin en augmentant le nombre de transporteurs membranaires sur les cellules hépatiques.

 

Parmi les protéines phosphorylées par PKB, il y a des protéines du cytosquelette et des protéines impliquées dans l’exocytose, favorisant la fusion de vésicules sous membranaires avec la membrane plasmique (stockage des transporteurs de glucose)

 

§  Récepteurs à activité sérine/thréonine kinase :

Cas des récepteurs de la superfamille du TGF–b

(transducing growth factors)

 

Ils agissent dans la mise en place des axes embryonnaires, sur la répartition des os, dans la reproduction et dans l’immunité.

Cf. poly

 

Les ligands de ces récepteurs appartiennent à une superfamille. Ce sont des dimères (homo ou hétéro) Les récepteurs sont classés en récepteurs de type I et récepteurs de type II.

 

Les récepteurs de type II présentent une partie extracellulaire spécifique au ligand et un domaine sérine/thréonine kinase qui est actif de manière constitutive. Cette kinase entraîne l’autophosphorylation du récepteur au niveau des résidus sérine/théonine.

 

-          Le ligand se lie à 2 récepteurs de type II.

Cette liaison fait qu’il y a une très haute affinité des récepteurs de type II pour les récepteurs de type I.

-          On a l’obtention d’un tétracomplexe.

-          Les récepteurs de type II phosphorylent ceux de type I au niveau d’une région spécifique.

-          Les récepteurs de type I deviennent actifs et phosphorylent des protéines substrat (SMAD)

-          La SMAD devient active et peut se lier à un Co–SMAD. Il y a alors formation d’un hétérodimère qui peut être transloqué dans le noyau.

-          Les SMAD sont des facteurs de transcription : elles peuvent se lier dans les régions promotrices des gènes (élément de réponse) et provoquent une régulation de la transcription des gènes (augmentation ou diminution)

 

§  Récepteurs à activité guanylate cyclase :

Cf. poly

Cas des ANP (Atrial Na+–triurétic peptide)

On ne retrouve l’ANP que chez les vertébrés. Il augmente la sécrétion de Na+ et diminue le volume et la pression sanguine. L’ANP agit via un récepteur : la guanylyl cyclase.

Elle hydrolyse le GTP en GMPC, entraînant la phosphorylation de protéines cibles et une augmentation du transport d’eau et de sels.

 

§  Récepteurs à activité phosphatase :

Cf. poly

 

Ce sont des récepteurs possédant une capacité de lier des ligands solubles ou des ligands d’adhésion.

L’interaction récepteur–ligand provoque une dimérisation, une polymérisation et une inhibition mutuelle des phosphatases.

 

§  Récepteurs à activité enzymatique associée :

Cf. poly

 

L’enzyme est recrutée par le récepteur. Il existe plusieurs catégories de récepteurs :

-          Les récepteurs de cytokines immunitaires qui régulent l’activation des cellules immunitaires,

-          Les récepteurs de l’hormone de croissance des vertébrés,

-          L’érythropoéitine (EPO) qui agit via des récepteurs proches de ceux de l’hormone de croissance.

Tous ces récepteurs sont associés aux JAK. Ceux–ci sont proches des récepteurs à activité tyrosine kinase.

-          La liaison du ligand se fait sur 2 récepteurs et provoque un changement de conformation. Les récepteurs vont recruter des JAK (= janus kinase)

Les JAK phosphorylent des protéines au niveau des résidus tyrosine. Il existe plusieurs JAK.

-          La JAK fixée devient active. Elle s’autophosphoryle et phosphoryle la région intracellulaire des récepteurs.

-          Les récepteurs peuvent alors recruter des protéines ayant des domaines SH2 ou PTK : les STAT (Signal Transducor Activator of Transcritption)

Les STAT possèdent des domaines SH2 et sont donc capables d’être recrutées par des protéines phosphorylées au niveau des résidus tyrosine.

-          Les STAT à proximité de la JAK vont être phosphorylées à leur tout près des résidus tyrosine.

-          Les STAT phosphorylées se détachent et vont se dimériser. Ces dimères peuvent être transportés dans le noyau.

-          Les STAT se fixent au niveau d’éléments de réponse spécifiques sur des régions spécifiques, entraînant une augmentation de la probabilité de transcription.

§  Récepteurs sans domaine intracellulaire :

Cf. poly : exemple du récepteur du GDNF (= facteur de croissance des cellules gliales)

 

Le GDNF se lie à des récepteurs spécifiques, sans domaine intracellulaire (= protéine périphérique ancrée à la membrane via des résidus glycosyl d’un glycolipide)

La liaison du GDNF permet le recrutement d’une protéine transmembranaire : activation d’une tyrosine kinase (réponse spécifique)

 

 

Ø  Récepteurs intracellulaires (nucléaires) à activité « facteur de transcription » :

 

Ils régulent la transcription des gènes cibles.

L’effet immédiat de l’hormone est la transcription des gènes.

 

Ces récepteurs sont des récepteurs de molécules signalisatrices de petite taille, hydrophobe (c’est–à–dire pouvant traverser la bicouche lipidique)

On distingue 2 catégories de ligands : les hormones stéroïdes (hormones sexuelles) et les hormones synthétisées par les surrénales (médiateurs de stress, glucocorticoïdes)

Les récepteurs de ces hormones sont cytosoliques.

 

Il existe des médiateurs dans les récepteurs qui sont nucléaires comme les hormones thyroïdiennes, la T3 (triiodothyronine), la T4 (tétraiodothyronine), etc.

Il existe aussi des médiateurs lipidiques comme l’acide rétinoïque.

 

§  Récepteurs cytosoliques d’hormones stéroïdes :

Cf. poly : prototype de récepteur

 

Il y a :

-          Un domaine N–terminal variable en fonction du type de récepteur,

-          Un domaine de liaison à l’ADN,

-          Un domaine de liaison au ligand.

Ce récepteur présente une structure en doigt à zinc.

 

Il existe des éléments de réponse avec au moins une partie qui est commune :

-          ERE : élément de réponse aux oestrogènes = Palindrome,

-          TRE : élément de réponse aux thyroïdes = Séquence répétée.

 

Les récepteurs aux glucocorticoïdes sont cytosoliques. Ils sont transférés dans le noyau, suite à la fixation du ligand.

 

 

Expérience : Mise en culture de cellules (exposées à plusieurs milieux de culture)

Cf. poly : translocation nucléaire

 

Le dex (= dexaméthazone) est un analogue de glucocorticoïde. Les cellules sont transfectées avec des plasmides renfermant des constructions particulières.

-          En A : on met l’ADNC de la b–galactosidase,

-          En B : on met l’ADNC du récepteur couplé à l’ADNC de la b–galactosidase

(protéine de fusion)

-          En C : on met l’ADNC de la b–galactosidase couplé au domaine de liaison de récepteur.

 

On essaie de détecter la b–galactosidase avec des anticorps :

 

 

– dexaméthazone

+ dexaméthazone

 

A

Localisation cytosolique

 

B

Localisation cytosolique

Localisation nucléaire

Þ Le récepteur est cytosolique et la fixation du ligand induit sa translocation nucléaire

C

Localisation cytosolique

Localisation nucléaire

Þ La région impliquée dans la transcription est bien celle qui lie le ligand.

Þ la fixation du ligand entraîne un changement de conformation qui entraîne démasquage du site nucléaire.

 

Cf. poly : récepteur couplé à une protéine chaperonne : HSP90

 

La liaison du ligand modifie la conformation du récepteur. Les récepteurs s’associent à des éléments de réponse spécifiques (comme SRE) Ils se fixent sous forme de dimères. Puis, il y a interaction avec d’autres protéines du complexe d’initiation de la transcription.

 

§  Récepteurs nucléaires d’hormones (TR) ou d’acide rétinoïque (RAR) :

Cf. poly : récepteur nucléaire

 

Les récepteurs sont nucléaires et se fixent sous forme d’hétérodimère au niveau des éléments de réponse.

Le récepteur de l’acide 9–Cis–rétinoïque est un hétérodimère (RXR)

 

Il existe un complexe protéique pour empêcher l’activation de la transcription : corépresseur.

Le recrutement d’un coactivateur favorise l’activation du complexe d’initiation de la transcription.

 

Pour l’acide rétinoïque, le récepteur RAR présente la même technique :

-          Le complexe corépresseur possède une activité histone désacétylase.

-          Le complexe coactivation possède une activité acétyltransférase.

 

Cf. poly : acétylation / désacétylation de l’ADN

 

La désacétylation permet l’accès des polymérases à l’ADN et entraîne la formation du complexe de transcription.

 

v Désensibilisation des récepteurs :

 

L’exposition des récepteurs à des concentrations trop longues ou trop forte en ligand entraîne une désensibilisation.

 

Cas des récepteurs couplés aux protéines G :

La fixation du ligand au récepteur entraîne un changement de conformation permettant des interactions entre les protéines G et le complexe hétérodimérique mais exposant les protéines G à des kinases GRK (G protein receptor kinase)

Les régions phosphorylées bloquent le couplage avec les protéines G et permet le recrutement d’une protéine b–arestine sur les régions phosphorylées du récepteur.

 

La b–arestine a 2 effets :

-          Elle prévient l’interaction entre les protéines G et les protéines G hétéromériques.

-          La réponse spécifique au ligand va décroître.

 

L’arestine sert d’adaptateur pour la polymérisation de clathrines, permettant l’endocytose des récepteurs (internalisation) et donc fait diminuer la réponse. Ces récepteurs internalisés peuvent être recyclés ou dégradés.

Þ Ce phénomène s’appelle la désensibilisation homologue : un ligand donné va induire une désensibilisation des récepteurs de ce ligand particulier.

 

Cf. poly : désensibilisation par phosphorylation et par internalisation

 

Il existe une désensibilisation hétérologue :

Il s’agit d’une désensibilisation globale avec une réponse moindre de la cellule pour l’ensemble des ligands.

Elle est due à la phosphorylation des récepteurs.

 

Ce phénomène régule plus ou moins la transcription du gène codant pour les récepteurs. Or, ces gènes sont souvent régulés par des facteurs de transcription dont l’activité est liée à l’activité kinase.

 

 

Contrôle du cycle cellulaire

 

v Introduction :

Ø  4 phases :

Et intégration des signaux mitogènes

 

Et duplication du centrosome

 

 

La mitose :

-          Disparition de l’enveloppe nucléaire (phosphorylation des lamines),

-          Compaction des chromosomes (phosphorylation des histones),

-          Alignement des chromosomes dupliqués (métaphase),

-          Séparation des chromatides sœurs (phosphorylation des cohésines),

-          Cytodiérèse.

 

 

Ø  Régulation du cycle :

 

-          Point de restriction (transition G1"S) :

C’est le point de départ qui engage irréversiblement la cellule dans le cycle.

-          Succession immuable des 4 phases :

Elle engage les cyclines et les kinases cycline–dépendantes (cdk)

-          Surveillance du cycle :

-          Point de contrôle de dommage de l’ADN (DDCP),

-          Point de contrôle de la réplication (RCP),

-          Point de contrôle de positionnement des chromosomes en métaphase (MCP)

 

 

 

v Cyclines et CDK :

Ø  Mise en évidence :

 

Elles ont été mises en évidence par la convergence de 3 thèmes de recherche :

-          La maturation de 3 œufs d’amphibiens : « maturation promoting factor » (MFP),

-          Les protéines enbryonnaires d’étoile de mer : cyclines,

-          La régulation mitotique : mutation « cell division cycle » (cdc)

 

§  La MPF (Maturation/Mitosis Promoting Factor) :

 

Ovogenèse et blocage de la méiose :

 

 


Phase S

 

Croissance

 

 

Ovulation

9   Division I de Méiose                                  = Maturation

 

           

                                                                                  " Émission du 1er globule polaire

Fécondation

9   Division II de Méiose                                = Activation

 

                                                                                  " Émission du 2ème globule polaire

 

 

Ovogonie                         Ovocyte

en vitellogenèse

 

 


                                     Vitellogenèse                    GVBD                      1er globule

  polaire

 


S                                             Prophase                       Métaphase   Anaphase   Métaphase

                                                                                               (M I)         Télophase      (M II)

GVBD : Rupture de la vésicule germinative.

 

 

Maturation :

-          Rupture des jonctions ouvertes entre les cellules folliculaires et l’ovocyte,

-          Migration de la vésicule germinative (futur pôle animal),

-          Remaniement cytoplasmique (clarification du vitellus),

-          GVBD :

-         Disparition de l’enveloppe de l’enveloppe nucléaire,

-         Condensation des chromosomes,

-          Formation du fuseau mitotique et de la plaque métaphasique.

 

Contrôle endocrine de cette maturation :

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


MIH : Hormones d’inductions de la maturation :

-          Progestérone (stéroïde) chez le xénope,

-          17_a_20_b_Di_Hydroxy_progestérone chez les amphibiens et les poissons,

-          1_méthyl_adénine chez l’étoile de mer,

-          Sérotonine chez les mollusques,

-          Progestérone chez les mammifères.

 

§  Expérience de micro–injection :

 

L'injection du cytoplasme prélevé dans un ovocyte II maturé (bloqué en métaphase II) dans un ovocyte I induit l'entrée en méiose de ce dernier. Cette expérience montre que le cytoplasme de l'ovocyte A contient un composé (MFP), présent en méiose, et suffisant pour induire le passage en méiose (= maturation = GVD et 1ère division méiotique)

§  Expérience de fusion de cellules :

 

Il est possible de réaliser la fusion de deux cellules qui sont à des stades différents du cycle cellulaire : on obtient alors un hétérocaryon (cellule contenant deux noyaux différents) avec mise en commun des cytoplasmes.

Ce modèle expérimental permet de savoir si une cellule donnée contient un facteur de stimulation d'une étape du cycle.

 

La fusion d’une cellule en mitose et d’une cellule en interphase (G1, G2 ou S) permet d'observer une condensation des chromosomes issus de la cellule en interphase.

Un facteur présent dans la cellule en mitose induit donc visiblement une "entrée en mitose" précoce du noyau de la cellule en interphase. Ce facteur est le MPF.

 

 

Fusion d'une cellule en interphase (ici phase G2) et d'une cellule en métaphase (phase M) :

Un facteur diffusible présent dans la cellule en phase M induit l'entrée en mitose (condensation des chromosomes et disparition de l'enveloppe nucléaire) de la cellule en phase G2.

Ce facteur est le MPF.

La fusion de toute cellule en interphase (même en phase G1 ou S) et d'une cellule en phase M induit la condensation des chromosomes et la disparition de l'enveloppe nucléaire.

 

 

Fusion d'une cellule en phase G1 (avant réplication) et d'une cellule en phase S (en réplication) :

Un facteur contenu dans le cytoplasme de la cellule en phase S agit sur les fibres chromatiniennes de la cellule en G1 pour induire la synthèse d'ADN. Il existe donc, dans le cytoplasme des cellules en phase S, un facteur de stimulation d'entrée en phase S.

Ce facteur correspond en fait à un complexe protéique, qui est de même nature que le MPF.

 

Ces expériences permettent donc de mettre en évidence que deux transitions importantes dans le cycle cellulaire, l'entrée en mitose et l'entrée en phase S, sont sous la dépendance de facteurs de régulation.

Facteur diffusible de même nature que le MPF

 

 

§  Cyclines :

 

Chez les embryons d’étoiles de mer ou d’oursin, les mitoses se font de manière synchrone. Il existe donc des protéines dont les concentrations oscillent en corrélation avec le cycle.

" Ce sont les cyclines.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Caractérisation des cyclines A (en phase S) et des cyclines B (en phase M) :

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


L’activité du MPF est partiellement corrélée à la cycline B.

 

La caractérisation de l’ADNc de la cycline B d’oursin permet l’élaboration de sondes moléculaires pour cribler des banques géniques et en extraire l’ADNc de la cycline B de xénope (analogie de structure)

Après en avoir élaborer la protéine recombinante, on fabrique des anticorps anti–cycline B. Ces anticorps reconnaissent d’une des sous–unités des MPF.

 

Etude du cycle embryonnaire précoce chez la palourde :

On analyse des œufs après fécondation. Après leur avoir injecté de la 35S–Methionine, on effectue une extraction des protéines avec une analyse par SDS–PAGE et une révélation par autoradiographie.

Cela montre qu’il y a de la cycline A et de la cycline B qui agissent, puis qui diminuent lors de la mitose (anaphase)

 

§  Régulation de la mitose chez la levure :

 

Exemple : Saccharomyces cerevisiae et S. pombe :

 

Il y a la recherche de mutations dans les gènes codant pour des molécules du cycle cellulaire. On a mis en évidence de 2 types de mutants :

-          Mutants cdc (cell divisions cycle) = arrêt du cycle,

-          Mutant wee (petit) = mitoses prématurées (= proliférations actives)

 


Saccharomyces cerevisiae :

S. pombe :


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Utilisation des souches (n) :

-          Saccharomyces cerevisiae (bourgeonnante) :

Absence de G2 (donc pas de GVBD)

 

 

 

 

 

-          Saccharomyces pombe (fissipare) :

 

 

 

 

 

 

Recherche systématique de gènes du cycle des levures :

Mutants thermosensibles :

-          Basse température : protéine mutée non fonctionnelle  Þ Prolifération

-          Haute température : protéine mutée fonctionnelle        Þ Arrêt du cycle de toutes les levures d’une même souche mutante à un stade donné du cycle.

 

Pour S. pombe :

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces pombe

Si mutation :

CDC28

cdc2

Arrêt au point de départ

SWI6

cdc10

Arrêt de la réplication

cdc25

Arrêt au niveau du point de contrôle d’entrée en mitose

WEE1

wee1

Entrée prématurée en mitose

(levures de petite taille)

 

Le gène cdc2 a un rôle pivot :

-          Sa mutation inactivatrice (cdc2) entraîne l’absence de mitose

" Cellules de grande taille

-          S’il n’est pas régulé (cdc2D hyperactif) entraîne une mitose prématurée

" Cellules de petite taille

 

Identification de 3 gènes dont les produits régulent cdc2 :

-          wee1 : son mutant wee1 engendre un phénotype correspondant à cdc2D.

-          cdc25: son mutant cdc25 engendre un phénotype correspondant à cdc2.

-          cdc13 : son mutant cdc13 engendre un phénotype correspondant à cdc2.

 

Mise en évidence de la relation entre cdc2 et MPF :

Stratégie de clonage :

Cellule mutante (absence de division à température élevée)

$

Transfections : plasmide + ADN aléatoire de cellule normale

$

S’il y a une division de la cellule, alors il y a une copie du gène cdc normal

$

Récupération du plasmide

$

Séquençage

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


-          cdc2 code pour une protéine kinase.

-          Les anticorps anti–cdc2 reconnaissent la sous–unité kinase du MPF.

-          Le séquençage de cdc13 (= protéine arrêtant le cycle) montre une homologie avec le gène de la cycline B.

-          La levure cdc2 transfectée par des plasmides ou des fragments ADN humains présente des divisions mitotiques. Le gène humain est homologue à celui de cdc2.

Conclusion :

-          L’entrée en mitose des levures et des vertébrés se fait par la même kinase.

-          La kinase doit être complexée avec une cycline pour être active.

 

Ø  Les complexes cycline–cdk et les 4 phases du cycle :

§  Mode d’action :

Cdk = sérine–thréonine kinase.

Cycline = sous–unité (activatrice) des cdks.

Cycline + cdk = complexe actif

Þ Phosphorylation de protéines cibles (Ser/Thr – Pro – X – Arg/Lys)

            Þ Modification des propriétés de la protéine cible

 

§  Structure des cdks :

 

-          Site de fixation de protéines cibles,

-          Domaine N–terminal (feuillets b) présentant des sites de liaison à l’ATP,

-          Une hélice a = signature des cdks = PSTAIRE (Pro – Ser – Thr – Ala – Ileu – Arg – Glu)

-          Acides aminés cibles de phosphatases ou de kinases (cdk1 : Thr14, Tyr15, Thr161) = boucle T

-          Domaine C–terminal riche en hélices a

 

La liaison à la cycline entraîne un changement de conformation de la cdk. Le site catalytique devient accessible, ce qui permet le positionnement d’une molécule d’ATP.

L’hélice PSTAIRE change de conformation en fonction de la présence ou on de Cys–A. la phosphorylation inhibitrice (cdk2 : Thr14, Tyr15) rend le site catalytique inaccessible.

 

§  Structure des cyclines :

 

Elles ont un poids moléculaire de 60 à 63kDa et sont constituées d’environ acides aminés. Elles ont une structure en hélice et présentent 2 domaines.

 

 

 

 

 

 

 


Il y a une séquence consensus : « destruction box » :

Cycline A :

Arg

Thr

Val

Leu

Gly

Val

Ile

Gly

Asp

Cycline B1 :

Arg

Thr

Ala

Leu

Gly

Asp

Ile

Gly

Asn

Cycline B2 :

Arg

Ala

Ala

Leu

Gly

Glu

Ile

Gly

Asn

Cette séquence est reconnue par le complexe APC (= Anaphase Promoting Complex) qui est une ubiquitine ligase.

 

§  Cycline–cdk et phases du cycle :

 

Les cyclines sont présentes à des moments précis du cycle. Une même cycline peut activer des cdk différentes. Une même cdk peut s’associer à des cyclines différentes.

 

Complexe cycline–cdk :

-          Bon déroulement du cycle,

-          Passage d’une phase à l’autre,

-          Réalisation des évènements du cycle.

 

Abondance des complexes cycline–cdk au cours du cycle :

Il y a une accumulation progressive (stock de complexe inactifs) puis une activation brutale.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Moment du cycle

Complexe Cycline / Cdk

Effets du complexe

G1

Cycline D / Cdk4

et

Cycline D / Cdk 6

  • Phosphorylation de la protéine Rb (Rétinoblastome), ce qui libère les facteurs de transcription E2F (synthèse des cyclines E et A)

G1/S

Cycline E / Cdk 2

  • Phosphorylation de la protéine Rb.
  • Duplication du centrosome (xénope)

S

Cycline A / Cdk 2

  • Réplication de l’ADN.
  • Phosphorylation de protéines de réplication A, de l’ADN pol, du complexe ORI, etc.
  • Inactivation de facteurs de transcription de la phase G1.
  • Duplication du centrosome chez les mammifères.
  • Arrêt de la dégradation de la cycline B qui s'accumule.

G2/M

Cycline B / Cdk 1

  • Dirige la transition G2/M par phosphorylation de nombreux substrats et conduit la progression de la mitose.

 

 

§  Régulation de l’activité des cdk :

 

(1)    Synthèse – dégradation des cyclines associées,

(2)    Kinases :

-          CAK (Cdk Activating Kinase) = cycline H / cdk7 ou autophosphorylation de cdc2,

-          Polo K,

-          Wee 1.

  ou      Phosphatases :

-          Cdc25 (activatrices ou inhibitrices)

(3)    Inhibiteurs CKI (cdk inhibitor) 3 familles :

-          Inks (Inhibitors of kinases),

= p15INK 4, p16INK 4, p18INK 4, p19INK 4.

" Liaison spécifique de cdk4 et cdk6.

-          Cips (Cdk inhibitory proteins),

-          Kips (Kinase inhibitory proteins)

= p21CIP 1, p27KIP 4, p54KIP 2.

" Liaison spécifique du complexe cdk2/cycline

" Masquage du site ATP

 

Changements de conform            ation :

-          Liaison de la cycline :

"  Accessibilité Thr14, Tyr15, Thr161 (cdk1) aux protéines régulatrices (kinases ou phosphatases)

"  Modification du site ATP.

-          CAK (cdk1, cdk4) :

"  Phosphorylation de Thr161,

"  Accès aux sites de protéines cibles.

 

-          Wee1 et cdc25 :

"  Phosphorylation de Thr14 et Tyr15,

"  Inhibition de l’accès de l’ATP.

-          CDI :

"  p21 bloque le site ATP,

"  p16 bloque la liaison de la cycline.

 

 

 

 

p53 est un facteur de transcription synthétisé lors d’une agression (apoxie, température, rayonnement) qui induit l’arrêt de la croissance et l’apoptose.

 

 

 

v Régulation de la succession des 4 phases :

Ø  Passage G0–G1 :

 

La cellule fille en sortie de mitose entre soit en prolifération (G1), soit en quiescence (G0) En G0, il n’y a pas de cyclines et E2F est inactif par la liaison pRb. Les facteurs de croissance ou mitogènes entraînent l’entrée de la cellule dans le cycle.

 

Exemple d’étude : Influence du facteur de croissance CTGF (Connective Tissue Growth Factor) dans le cas de néphropathies (utilisation d’une lignée cellulaire) :

-          Cytométrie en flux :

 

G0/G1

S

G2/M

 

Témoin

91%

2%

7%

Absence de progression G1"S

+ CTGF

91%

3%

6%

+ TGF

91%

3%

6%

+ FCS (sérum de veau fœtal)

58%

12%

30%

Progression G1"S

 

-          Il y a l’activation de la voie ERK par le facteur de croissance.

-          L’induction des inhibiteurs des cdk (western blotting) permet le maintien de pRb sous une forme non phosphorylée.

 

Ø  Passage G1–S :

§  Voie Ras :

 

 

 

 

 

 

§  G1 précoce :

 

Le complexe cycline D / cdk4 agit sur pRb en libérant le facteur de transcription E2F, ce qui permet la transcription de la cycline E.

 

Il y a une boucle d’amplification :

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Le point de restriction est la limite de G1 précoce / G1 tardif.

 

 

 

 

 

§  Passage du point de restriction :

 

Il correspond à l’activation des complexes :

-          Cycline D / cdk4,

-          Cycline A / cdk2,

-          Cycline E / cdk2.

Þ Cela permet l’induction de la réplication des chromosomes :

-          ADN polymérase, ligases, topoisomérases,

-          Enzymes synthétisant les nucléotides,

-          Protéines structurales (histones),

-         Facteurs d’initiation de la réplication, etc.

Þ Cela entraîne la duplication du centrosome.

 

La nucléophosmine se lie au centrosome à la fin de la mitose, bloquant ainsi sa duplication. Le complexe cycline E / cdk2 phosphoryle la nucléophosmine qui se détache du centrosome.

Il y a une augmentation de l’activité de la kinase calmoduline Ca2+ dépendante (CAM KII) qui permet la duplication du centrosome.

 

Ø  Passage G2–M = entrée en mitose :

 

Il y a la dégradation de la cycline A, accompagnée par l’accumulation progressive du complexe cycline B / cdk1. Cdk1 est phosphorylé sur le Thr161 par la CAK mais reste inactif car 2 autres phosphorylations sont nécessaires sur Thr14 et Tyr15 par Wee1.

 

= Pré–MPF cytoplasmique

 

L’activation du complexe cycline B / cdk1 est brutale :

-          Passage nucléaire de cdc25 en fin de G2,

-          Activation de cdc25 par la polokinase 1 (= Plk1)

-          Elimination des 2 phosphores du site ATP.

 

Il y a aussi une auto–activation de cdc25 par le complexe cycline B / cdk1 et l’inactivation de Wee1 phosphorylé par ce même complexe.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Cdc25 présente des séquences de localisation cytoplasmique (Cy), nucléaires (NLS) et d’exportation (NES)

 

Le complexe cycline B / cdk1 phosphoryle plusieurs protéines cibles :

-          La condensine et l’histone H1

Þ  Condensation des chromosomes

-          Les lamines

Þ  Désorganisation de l’enveloppe nucléaire

-          Les MAPs

Þ  Assemblage du fuseau mitotique

-          L’APC

(Anaphase Promoting Complex = cyclosome)

Þ  Assemblage du fuseau mitotique

-          Cdc20

(= adaptateur)

 

Il reconnaît aussi les protéines avec un signal de destruction de nucléotides comme la cycline A et la sécurine.

 

La cohésion et la séparation des chromosomes se fait par la cohésinr. Il s’agit du complexe protéique responsable de l’association des chromatides sœurs. Il est composé de plusieurs sous–unités :

-          Smc1 + Smc3 (Structural Maintenance of Chromosomes)

-          Scc1 + Scc3 (Sister Chromatid Cohesion)

 

 

 

 

 

 

 

 

 


                                                                                                           

Lors de la métaphase, il y a la phosphorylation de la cohésine (au niveau de Scc1) par la Plk1, ce qui la rend sensible à la protéolyse.

 

Au début de l’anaphase, il y a la dégradation de la cohésine par la séparase (= endopeptidase de type carpase) La séparase est sous sa forme inactive lorsque elle est associée à la sécurine. L’ubiquitinisation de la sécurine (APC / cdc20) et sa dégradation entraîne la libération de la séparase. Elle va alors être phosphorylée par le complexe cycline B / cdk1, ce qui la rend active.

 

Ø  Sortie de mitose :

§  Inactivation du complexe cycline B / cdk1 :

 

Il se fait par la protéolyse ubiquitine dépendante de la cycline B.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Cdh1 est un adaptateur (cycline B, cdc20, etc.)    

 

v Les points de contrôle du cycle :

 

Arrêt du cycle si :

-          Lésions de l’ADN : DDCP (DNA Damage CheckPoint)

Þ Arrêt en G1, S ou G2

Þ Absence de transition G1–S.

 

-          Anomalie de la réplication : RCP (Replication CheckPoint)

Þ Absence de transition G1–S.

 

-          Anomalie de la répartition équitable des chromatides sœurs (liaison des fibres kinétochoriennes : MCP (Mitotic CheckPoint)

Þ Absence de transition métaphase anaphase.

 

Molécules mises en jeu :

-          Kinases de liaison à l’ADN :

-          Kinase ATM (Ataxia–télangiectasia mutée)

Elle est activée par les radiations ionisantes et les coupures doubles brins.

-          Kinase ATR (Ataxia–télangiectasia related)

Elle est activée par les UV et les erreurs de réplication.

-          Kinase ATM (Ataxia–télangiectasia mutée)

Elle est activée par les radiations ionisantes et les coupures doubles brins.

 

-          Sérine–thréonine kinases :

-          Chk1 (ChckPoint protein kinase 1)

-          Chk2 (ChckPoint protein kinase 2)

 

-          Protéine MAD2 (Mitotic Arrest Deficient 2)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Ø  Blocage G1–S :

 

 

Ø  Blocage G2–M :

 

Ø  Blocage métaphase–anaphase :

APC = Anaphase Promoting Complex

 

 

v Cycle et apoptose :

Ø  p53 : rôle pivot :

 

50% des tumeurs humaines sont dues à la mutation de p53. Les cellules normales présentent un niveau faible de p53. Des dommages de l’ADN entraînent une augmentation de p53.

p53 est un activateur transcriptionnel. Il a 3 fonctions :

-          L’arrêt de la croissance avec l’activation de p21,

-          La réparation de l’ADN,

-          L’apoptose.

 

§  Régulation de p53 par Mdm2 (Mouse double minute 2) :

 

L’expression de Mdm2 est activée par p53.

 

 

 

 

 


Liaison de p53 non phosphorylé par Mdm2

Þ ubiquitination Þ