v Fonctions du cytosquelette :

Ø  Architecture cellulaire :

§  Structures stables à base de tubuline :

 

Paires de centrioles (diplosome, centrosome) :

Les centrioles sont toujours présents en paire. De leurs centres par des microtubules rayonnants. Ils sont constitués de 9 triplets dont 3 qu’ils ont en commun.

Longueur = 0,6µm ; Diamètre = 0,2µm

 

Corpuscules basaux :

Il s’agit des origines des axonèmes (cils et flagelles) qui consistent en la projection de microtubules à partir de ces corpuscules basaux. Ils présentent des lames rayonnantes.

Leur organisation se fait en triplets (au nombre de 9) avec une structure tubulaire centrale différente des microtubules.

 

Cils et flagelles :

Ils ont pour fonction le déplacement de la cellule et le déplacement de substances autour de la cellule (fluide, mucus, etc.)

Leur structure présente 9 doublets en cercle autour de 2 microtubules centraux. Chaque doublet est composé d’un microtubule complet (A) et d’un autre incomplet (B)

D’autres protéines sont présentes :

-          La dynéine qui a une activité ATPasique tous les 24nm.

-          La nexine qui est une protéine extensible maintenant les doublets adjacents entre–eux.

 

§  Structures stables à base d’actine :

 

Il s’agit d’édifices stables situés dans les cellules ciliées où les filaments d’actine sont organisés en réseau ou en faisceaux. Ces filaments sous–membranaires liés à des protéines de liaisons forment le cortex cellulaire.

 

Les filaments d’actine permettent la formation de la membrane plasmique des cellules animales. Exemples :

-          Protusions fines et épineuses (microspicules),

-          Extensions en feuillets chez les lamellibranches,

-          Invaginations dues à des faisceaux contractiles associés à la myosine (microvillosités)

 

§  Polarité cellulaire :

·         Filaments cytosquelettiques connectés : fonctions coordonnées :

 

Polarisation d’une cellule :

-         Signal sur un coté de la cellule = Signal transmembranaire,

-         Cortex d’actine réorganisé localement,

-         Déplacement du centrosome (microtubules),

-          Positionnement des organites.

 

Exemple :  Lymphocyte T cytotoxique :

-         Reconnaissance récepteur–antigène,

-         Signal sur le cortex sous–jacent,

-         Réorganisation de l’actine,

-         Réorientation du centrosome,

-          Positionnement du golgi (vésicules de sécrétion)

 

§  Importance des filaments intermédiaires :

 

Les cellules différenciées ne se divisant plus et ayant une absence de cellules embryonnaires, les filaments intermédiaires ont un rôle statique et structural.

C’est le cas dans les cellules épithéliales où des faisceaux de kératine traversent le cytoplasme et relient les desmosomes. Cela permet l’accrochage des cellules entre–elles.

Les filaments intermédiaires ont aussi un rôle dans la structure du noyau (lamina propria)

 

Ø  Mouvements intracellulaires :

§  Kinésines, dynéines et transport intracellulaire :

 

Le transport de protéines, organites ou de vésicules membranaires dans le cytosol se fait le long des microtubules. Ce transport nécessite l’hydrolyse de l’ATP. C’est le rôle des protéines motrices des microtubules : les kinésines et dynéines cytoplasmiques.

(N.B : Les protéines motrices des filaments intermédiaires sont les myosines)

 

Etude in vitro des mouvements des mélanophores :

Les mélanophores sont les pigments situés dans les cellules pigmentaires d’écaille de poisson. Ces cellules sont plates et de grande taille. Les granules pigmentaires sont soit agrégés au centre, soit dispersés.

 

-          In vivo, un contrôle hormonal régit le mouvement de ces pigments, induisant un changement de couleur du poisson.

-          In vitro, un ajout d’AMPc induit la dispersion des pigments (signalisation intracellulaire)

 

Le Pulse–Chase permet la mise en évidence du transport axonal et l’identification des protéines transportées.

Compréhension du transport axonal :

-          Les microtubules assemblés in vitro et stabilisés par le taxol ; il y a présence de vésicules synaptiques.

Þ  Absence de liaison et de mouvement.

 

-          Même situation avec ajout d’extrait cytoplasmique dépourvu de tubuline.

Þ  Liaison et mouvements.

 

-          Les microtubules + vésicules synaptiques + cytosol + analogue non hydrolysable d’ATP.

Þ  Liaison mais absence de mouvement.

 

Conclusion :  Des protéines cytosoliques lient les vésicules synaptiques aux microtubules en présence d’ATP mais le mouvement nécessite l’hydrolyse de l’ATP.

 

Purification :

-          Incubation de microtubules avec des extraits de cerveau et un analogue non hydrolysable d’ATP.

-          Centrifugation " Récupération de complexes microtubules–protéines.

-          Relargage des protéines avec de l’ATP " Obtention principalement de kinésine.

 

Tests in vitro :

On observe le mouvement des microtubules individuels sur une surface de verre recouverte d’extrait cellulaire ou protéique. Cela a permis l’identification de 2 classes de protéines motrices des microtubules :

-          Les dynéines :   Mouvement vers le pôle (–) du microtubule  = Moteur (–)

Elles permettent le transport rétrograde des organites, la mitose. Elles sont apparentées à la dynéine ciliaire (cils et flagelles)

-          Les kynésines : Mouvement vers le pôle (+) du microtubule  = Moteur (+)

Elles permettent le transport antérograde (organites et des vésicules synaptiques), la mitose et la méiose.

 

 

 

v Cytosquelette et mitose (suite) :

Ø  Dynamique des microtubules et des protéines motrices au cours de la mitose (suite) :

 

A chaque pôle, un centrosome organise 3 types de microtubules :

-          Les microtubules des asters :

"  Leurs extrémités (–) sont orientées vers le centrosome et leurs extrémités (+) vers le cortex cellulaire. Ils permettent le positionnement du fuseau mitotique et déterminent le plan de clivage.

-          Les microtubules du kinétochore :

"  Ils permettent la connexion des chromosomes à chaque pôle (bipolaire)

-          Les microtubules polaires :

"  Il y a une absence d’interactions avec les chromosomes. Ces microtubules développent des interdigitations avec les microtubules polaires opposés.

 

§  Assemblage du fuseau mitotique : protéines motrices :

 

-          Fonction de l’organisation du fuseau aux pôles,

-          MAPs = protéines dynamiques des microtubules (catastrophe/sauvegarde)

-          Protéines motrices = moteurs moléculaires.

Þ Organisation spatiale des microtubules en structure bipolaire.

 

·         Kinésines et dynéines :

 

Etudes chez la levure et la drosophile :

-          L’injection de protéines apparentées aux kinésines (KRPs et KLPs) permet la séparation et la migration des centrosomes.

Þ  Ces protéines sont donc responsables de l’orientation des microtubules polaires et des asters.

-          L’injection d’anticorps anti–KRP inhibe la formation du fuseau bipolaire (si injection dans la cellule avant la prophase.

Þ  Il y a une importance de la dynéine cytosolique localisée au niveau du centrosome et du cortex. Elle permet le mouvement du centrosome et l’orientation du fuseau.

 

Moteurs à polarité (+) :

Cela concerne en majorité les kinésines :

-          La famille Bin C (identifiée chez la levure),

-          XKLP1, XKLP2, Eg5 (xénope) :

-          XKLP1 lie les chromosomes,

-          XKLP2 lie les centrosomes,

-          Eg5 permet le pontage de 2 microtubules (2 paires de domaines moteur)

 

Moteurs à polarité (–) :

Cela concerne les dynéines et les kinésines XTCK2.

 

·         Formation du fuseau :

 

Arrêt en phase M :

On prélève un extrait « mitotique » (sans centrosome) et on observe l’assemblage in vitro de fuseau mitotique en présence d’ADN de spermatozoïde ou de billes recouvertes de chromatine (= chromosomes artificiels)

Conclusion : Les centrosomes ou les kinétochores ne sont pas nécessaire à la formation du fuseau, mais les protéines motrices sont indispensables.

 

 

Etape 1 : Nucléation des microtubules à partir des billes :

L’orientation se fait de manière aléatoire.

Etape 2 : Tri des microtubules, selon leur polarité, par des protéines motrices :

-          Eg5 repousse les extrémités (–) des microtubules et permet l’orientation antiparallèles des microtubules.

-          XKLP1 tire les microtubules en ramenant les extrémités (+) vers l’ADN.

Etape 3 : Formation des pôles :

-          Liaison de plusieurs microtubules,

-          Déplacement du complexe vers les extrémités (–),

Þ  Focalisation des extrémités (–) aux pôles.

 

Conclusion :

Les moteurs (+) éloignent les 2 pôles (centrosomes) Les moteurs (–) rapprochent les 2 pôles. Un équilibre règle la distance entre les 2 pôles.

 

§  Mouvement des chromosomes : kinétochore et microtubules kinétochoriens :

 

Le kinétochore est le site d’attachement des microtubules au centromère. Il assure la ségrégation des chromosomes entre les cellules filles.

Les microtubules kinétochoriens présente une plus grande stabilité que les microtubules du fuseau.

 

Une couronne fibreuse se forme à partir de dynéine cytosolique et de protéines apparentées à la kinésine (CENP–E) Le disque externe est composé de CENP–F et de hBUBR1.

Le disque interne est composé de protéines reconnues par des anticorps produits par des patients souffrant de sclérodermie.

 

Formation et fonctionnement de la fibre kinétochorienne :

-          Rupture de l’enveloppe nucléaire : interaction aléatoire des microtubules et des centrosomes avec les kinétochores (dynamique des microtubules)

-          Capture et ancrage d’un microtubule polaire par les MAP CLIP–170 associées au kinétochore.

-          Transport du kinétochore vers le pôle du fuseau (dynéine)

-          Ancrage et maintien des extrémités (+) des microtubules dans le kinétochore par la kinésine CENT–E (microtubules kinétochoriens)

Þ Mouvement du chromosome

 

Anaphase :

Elle consiste en la dépolymérisation de l’extrémité (+) du microtubule par la kinésine CENT–E.

 

§  Importance des chromosomes dans la dynamique du fuseau :

 

Lors de la prophase, les microtubules croissent vers les chromosomes. Ces derniers ont un rôle essentiel dans la formation du fuseau de division (polymérisation/dépolymérisation des microtubules)

 

La cinétique de polymérisation des microtubules est contrôlée par les MAPs, elles–même régulées par des facteurs du cycle cellulaire.

 

-          En interphase, les microtubules sont longs et stables (½ vie @ 15min)

-          En phase M, ils se raccourcissent et deviennent instables (½ vie @ 90s)

Cdk1 entraîne la phosphorylation XMAP 215 (= protéine stabilisatrice) ce qui inactive XMAP 215 et déstabilise les microtubules cellulaires.

 

La chromatine favorise l’assemblage des microtubules du fuseau :

-          L’élimination d’un chromosome entraîne la réduction de la quantité de microtubule.

-          La cinétique in vitro montre que le microtubule au contact de la chromatine est d’avantage en « sauvetage » qu’en « catastrophe ».

-          L’injection d’ADN phagique dans des œufs de xénope entraîne la formation bipolaire de microtubules.

 

L’effet de la chromatine implique la protéine Ran (= petite GTPase de la famille Ras), une enzyme active s’il y a la présence de GAP (GTPase Activating Protein) et inactive en présence de GEF (Guanosine Exchange Factor)

 

Si les COMTs sont à proximité du noyau, il y a la rupture de l’enveloppe nucléaire et le développement des microtubules centrosomiques.