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Le cycle de Krebs

 

v Introduction :

 

Par un mécanisme de dégradation, la glycolyse, on obtient du pyruvate. Ce dernier va subir une décarboxylation oxydative, puis entrer dans un mécanisme d’oxydations successives pour finir en CO2. Ce cycle est appelé cycle des acides décarboxyliques ou encore cycle de Krebs.

 

Pour découvrir ce cycle, Krebs s’est inspiré de ses travaux antérieurs avec Henselut sur le cycle de l’urée.

 

La plaque tournante de ce cycle est la découverte de l’Acétyl_CoenzymeA (ou Acétyl_CoA)

 

Du cycle de Krebs résulte la formation de CO2 et d’une réserve énergétique utile à la biosynthèse (= formation de macromolécules)

Il se déroule essentiellement dans les mitochondries alors que la glycolyse se déroule dans le cytoplasme. Il se pose donc le problème du passage au travers de la double membrane mitochondriale (utilisation de transporteurs)

 

v Décarboxylation oxydative de l’acide pyruvique :

 

In vitro :

CH3–CO–COOH  +  ½ O2  Þ  CH3–COOH  +  CO2

 

In vivo :

       L’acide acétique n’est pas un bon métabolique.

 

Il y a formation d’un CO2 et transformation immédiate de l’acide pyruvique en un composé C2 appelé, faute de mieux à l’époque, « Acétate actif ».

C’est la forme qui peut entrer dans le cycle de Krebs par condensation avec un acide oxaloacétique, formant ainsi un acide citrique.

 

                                                                                                 CH2–COOH

       « Acétate actif »  +  COOH–CH2–CO–COOH  Þ              OH–CH–COOH

                                                                                                 CH2–COOH

                                          acide oxaloacétique                       acide citrique

 

Ø  Nature de l’Acétate actif :

 

Lipmann, 1946 : découverte du CoenzymeA (= HS–CoA)

 

Cf. page 6

 

 

Lyman, 1951 : découverte de l’Acétyl_CoenzymeA  (= CoA–S ~ CO–CH3)

Cf. page 6

∆G0  =  –7,52 kCal

 

Le groupement actif est le groupement –SH.

 

CH3–CO–COOH  +  HS–CoA          Þ       CoA–S ~ CO–CH3  +  CO2

                     Acide pyruvique          CoA réduit                           Acétyl_CoA

                                                                    NAD+       NADH+H+

 

Cette réaction est catalysée par l’enzyme Co–carboxylase (ou acide lipoïque)

Cf. page 8

 

Ø  Mécanisme de la réaction de décarboxylation oxydative de l’acide pyruvique :

 

Cette réaction est catalysée par le complexe enzymatique de la pyruvate déshydrogénase.

Lorsque plusieurs enzymes sont en jeu, un complexe multienzymatique a les avantages :

-          D’être plus stable qu’une enzyme isolée,

-          Une étroite proximité d’une enzyme à l’autre permettant :

-          D’éviter des réactions parasites,

-          D’accélérer la réaction.

(le produit de l’une est immédiatement le substrat de l’autre)

 

Cf. page 9

Cf. page 7

 

§  1ère étape :

 

Le TPP est tout d’abord ionisé pour présenter un carbanion (et un N+ qui joue le rôle de puit à électron pour stabiliser le carbocation) Le groupement carboxyle du pyruvate se fixe au TPP et subit ensuite la décarboxylation.

Cf. page 10

 

§  2ème étape :

 

Le groupement hydroxy–éthyle lié au TPP va être oxydé pour former un groupement acétyle. Simultanément, ce groupement va être transféré sur la Lipoamide. On retrouve le carbanion du TPP.

 

Le site actif est le pont disulfure S–S et va servir d’oxydant. Il est fixé à l’enzyme par une longue chaîne latérale flexible (= résidu Lysine)

Cf. page 11

 

§  3ème étape :

 

Le groupe acétyle est transféré de l’Acétyl_Lipoamide sur le CoenzymeA réduit pour former l’Acétyl_CoA et on retrouve la Dihydrolipoamide.

Cf. page 12

 

§  4ème étape :

 

Il y a la régénération de la forme oxydée de la Lipoamide avec le concours d’un FAD réduit en FADH2.

Cf. page 12

 

§  Résumé :

 

les intermédiaires sont transférés d’un site à l’autre par le groupement prostatique de la Transacétylase (long bras flexible)

Il correspond à un cordon entrant en interaction avec la TPP de la sous–unité de la déshydrogénase adjacente, avec l’unité flavinique de la Dihydrolipoyl Transacétylase et avec la Dihydrolipoyl Déshydrogénase.

Cf. page 13

 

v Cycle de Krebs proprement dit :

Ø  Principe d’ensemble :

 

L’acide oxaloacétique (C4) se condense avec l’Acétyl_CoA (C2) pour former le citrate (C6) qui présente une isomérisation. Cet isomère subit deux décarboxylations oxydatives et donne le succinate (C4) et va régénérer l’acide oxaloacétique (C4)

 

Le C2 rentre dans le cycle est plus réduit que les deux CO2 qui en sorte. Il doit sûrement y avoir des réactions d’Oxydoréduction.

En effet, il y a :

-          3 ions hydrures (= électrons) qui se fixent au NAD+ pour former du NADH+H+,

-          2 ions hydrures qui se fixent au FAD pour former du FADH2.

En s’oxydant, les NAD+ et FAD fournissent l’énergie nécessaire pour former 11 molécules d’ATP. On remarque qu’ils font partie de la chaîne des transporteurs d’électrons.

 

On observe aussi la sortie d’un GTP dont la structure ressemble à celle de l’ATP. Il est d’ailleurs très facilement transformé en ATP.

Cf. page 14

 

Ø  Condensation de l’acide oxaloacétique avec l’Acétyl–CoA :

 

Il s’agit d’une condensation aldolique suivie par une hydrolyse catalysée par la Citrate synthétase. La réaction présente une molécule intermédiaire entre la condensation et l’hydrolyse : la citrileCoA. C’est cet intermédiaire qui crée la force motrice de la formation du citrate.

Cf. page 15

 

Ø  Isomérisation du citrate en iso–citrate :

 

Elle permet au citrate de subir la décarboxylation oxydative. Elle se déroule en 2 étapes :

-          Déshydratation (élimination d’un –OH),

-          Hydratation (ajout d’un –OH) sur un autre carbone.

 

L’isomérisation est catalysée par l’Aconitase et présente une molécule intermédiaire : la Cis–aconitase.

Cf. page 15

 

Ø  Oxydation et décarboxylation de l’iso–citrate en a–cétoglutarate :

 

Il s’agit de la 1ère oxydation du cycle. Elle est catalysée par l’Iso–citrate déshydrogénase et présente une molécule intermédiaire : l’oxalosuccinate qui va rapidement perdre un CO2 pour former  a–cétoglutarate.

 

Cf. page 16

 

La plus part des déshydrogénases travaillent avec le NAD+ /NADH+H+. Il existe 2 types de déshydrogénases :

-          Travail avec NAD+ dans les mitochondries,

-          Travail avec NADP+ dans le cytoplasme et un peu de mitochondries.

 

Régulation :

-          Stimulation par ADP,

-          Inhibition par l’ATP.

 

Les dépenses d’énergie par l’organisme se fait par la déphosphorylation de l’ATP en ADP.

 

La présence donc d’ADP signale une consommation d’énergie qui active le cycle. Il y aura alors phosphorylation d’ADP pour régénérer l’ATP.

 

 

Ø  Décarboxylation oxydative de l’a–cétoglutarate :

 

a–cétoglutarate  +  CoA  +  NAD+  Þ  Succinate_CoA  +  CO2  +  NADH+H+

 

" forte ressemblance avec :

pyruvate  +  CoA  +  NAD+  Þ  Acétyl_CoA  +  CO2  +  NADH+H+

 

On observe d’ailleurs les mêmes cofacteurs…

-          TPP,

-          Lipoamide,

-          CoenzymeA,

-          FAD,

-          NAD+.

 

… et le même genre système de complexe enzymatique, ici le complexe de la Succinyl_CoA_synthétase avec :

-          L’a–cétoglutarate déshydrogénase : A’,

-          La Transsuccinylase : B’,

-          La Dihydrolipoyl déshydrogénase : C’.

 

Elle se déroule aussi en 4 étapes.

 

Cf. page 16

 

 

§  1ère étape :

 

Il s’agit d’une décarboxylation : il en résulte la formation d’un a–succinaldéhyde (et l’élimination d’un CO2 )

 

§  2ème étape :

 

Il s’agit d’une oxydation par l’acide lipoïque : il en résulte la formation d’une liaison acyl–thiol entre l’acide lipoïque réduit et le radical succinyle.

 

§  3ème étape :

 

Le radical succinyle est transféré sur le CoenzymeA (CoA~SH) Il en résulte la formation du Succinyl_CoA.

 

§  4ème étape :

 

La réaction se termine par la ré–oxydation de l’acide lipoïde par le NAD et la transformation du Succinyl_CoA en Succinate.

 

 

Ø  Régénération de l’oxaloacétate par oxydation du succinate :

 

Elle se déroule en 3 étapes.

Cf. page 17

 

§  1ère étape :

 

Il s’agit d’une oxydation catalysée par la Succinate déshydrogénase qui travaille avec la FAD. Elle fait partie de la membrane interne de la mitochondrie (les autres enzymes sont dans la matrice) et elle est directement liée à la chaîne de transporteurs d’électrons.

 

Elle contient 4 atomes de Fer et 4 atomes de Sulfure inorganique.

Le FADH2 produit ne se dissocie de l’enzyme : il reste fixé par une liaison covalente. Les 2 électrons du FADH2 sont transférés directement sur les atomes de Fer de l’enzyme. L’accepteur final sera l’Oxygène.

 

§  2ème étape :

 

Il s’agit d’une hydratation du furamate catalysée par une enzyme spécifique qui forme du malate de conformation lévogyre uniquement.

 

§  3ème étape :

 

Il s’agit d’une oxydation avec comme accepteur d’Hydrogène : le NAD+.

 

Ø  Bilan stoechiométrique :

 

-          2 atomes de Carbone entrent dans le cycle par l’Acétyl_CoA,

2 atomes de Carbone (différents de ceux qui sont entrés) sortent sous forme de CO2.

 

-          4 paires d’Hydrogène quittent le cycle lors de l’oxydation.

 

-          2 molécules d’eau sont consommées.

Cf. page 17

 

-          3 ATP sont formés par 1 NADH+H+,

2 ATP sont formés par 1 FADH2,

1 ATP est formé par 1 GTP,

Cf. page 18

 

Le cycle de Krebs est strictement aérobie (même si l’O2 moléculaire n’intervient pas à ce niveau) contrairement à la glycolyse qui peut fonctionner en condition anaérobie.

 

v Le cycle de Krebs : source de processus biosynthétiques :

 

La cellule va puiser dans des éléments du cycle pour former d’autres molécules ; par exemple, le Carbone des porférines proviennent du Succinyl_CoA. Également, beaucoup d’acides aminés vont être former à partir du a–cétoglutarate.

 

Cf. page 19

 

Le cycle est à l’origine de beaucoup de biosynthèse et il doit être réapprovisionné en conséquence. Il faut de l’oxaloacétate car l’Acétyl_CoA ne peut entrer directement dans le cycle qu’en se condensant en oxaloacétate par la carboxylation à partir du pyruvate (catalysée par la pyruvate carboxylase) Il s’agit d’une réaction anaplérotique (= réaction de réapprovisionnement de l’oxaloacétate)

 

v Le contrôle du complexe pyruvate–déshydrogénase :

Ø  Régulation autour du cycle de Krebs :

 

Chez les animaux, il est impossible de convertir l’Acétyl_CoA en glucose. L’engagement des atomes du glucose (le pyruvate vient du glucose) se fait vers 2 voies potentielles :

-          La production concomitante d’Acétyl_CoA,

-          L’incorporation dans les lipides.

 

Cela nécessite donc une régulation fine.

Cf. page 19

 

Il y a 3 types de mécanismes régulateurs :

 

-          Inhibition par les produits (Acétyl_CoA, NADH, le coenzyme A) de la Transacétylase.

 

-          Rétro–inhibition par les nucléotides (ATP–ADP) qui correspond par la charge énergétique de la cellule (le phosphate est riche en énergie)

 

La charge énergétique s’exprime :

                                                           [ATP]  +  ½ [ADP]

 


                                                      [ATP]  +  [ADP]  +  [AMP]

 

Et va de 0 (où il n’y que de l’AMP) à 1(où il n’y que de l’ATP)    La moyenne biologique est de 0,8 à 0,95.

 

Les travaux d’Atkinson : les voies métaboliques génératrices d’ATP sont inhibé par concentration élevée d’ATP (= charge électrique importante) et stimulée à l’inverse.

 

La composante pyruvate–déshydrogénase est inhibée par la GTP et activée par AMP.

" Ce sont des activateurs halostériques.

-          Régulation par modification covalente :

 

" Le complexe devient inactif lorsqu’un résidu sérine de l’enzyme est phosphorylé par ATP sur un groupement OH.

 

 

La désactivation de l’enzyme par phosphorylation augmente lorsque l’on a :

-          Une charge énergétique élevée,

-          Un rapport Acétyl_CoA / Coenzyme A élevé,

-          Un rapport NADH+H+ / NAD élevé.

 

L’activation de l’enzyme par déphosphorylation augmente lorsque l’on a :

-          Un taux élevé de pyruvate

 

 

Le groupement phosphoryle est hydrolysé par une phosphatase spécialisée.

 

Þ Tout ça régule autour du cycle de Krebs.

 

 

Ø  Régulation dans le cycle de Krebs :

 

-          La synthèse de citrate : l’ATP se comporte comme inhibiteur halostérique de la citrate–synthétique.

 

-          L’iso–citrate déshydrogénase : l’ADP se comporte comme activateur halostérique de la citrate–synthétique.

 

" Il y a une augmentation ou une diminution de l’activité de l’enzyme par les substrats.

 

 

-          L’a–cétoglutarate déshydrogénase : l’inhibition se fait par les produits de la réaction (Succinyl_CoA et …)

 

" Il y a une diminution de l’activité de l’enzyme avec une charge énergétique élevée.

 

 

 

L’entrée d’éléments à 2C et la vitesse sont réduites par un taux d’ATP élevé.

 

 

 

 

 

 

 

Transport des électrons et phosphorylation oxydative

 

Comment l’arrachement des électrons dans le cycle permet–il la formation d’ATP.

 

 

v Introduction :

 

Le NADH+H+ et le FADH2 sont formés dans le cycle de Krebs, lors de la glycolyse et lors d’oxydation d’acides gras.

 

Ces molécules sont riches en énergie parce qu’elles contiennent 1 paire d’électrons à fort potentiel et leur transfert à un Oxygène moléculaire libère une grande quantité d’énergie.

 

 

La phosphorylation oxydative est un processus de formation de l’ATP quand les électrons sont transférés à un O2. Il s’agit d’une source d’ATP pour les organismes aérobies.

 

32 des 36 molécules d’ATP de la décarboxylation du glucose sont issus plus particulièrement de la phosphorylation oxydative. Cette dernière est effectuée dans les complexes respiratoires localisés dans la membrane interne des mitochondries.

Cf. page 21

 

La mitochondrie est un très bon exemple de relation entre la structure et la fonction : si on désorganise sa structure, la mitochondrie perd sa fonctionnalité.

 

La voie d’oxydation des acide gras et le cycle de Krebs se passent dans la matrice adjacente.

 

 

L’oxydation du NADH+H+ entraîne la formation de 3 ATP.

L’oxydation du FADH2 entraîne la formation de 2 ATP.

9  Ces processus sont couplés.

 

 

L’ensemble respiratoire contient des transporteurs d’électrons tel que le Cytochrome. Le transfert des électrons à travers ces transporteurs se fait étape par étape pour « saucissonner » l’énergie. Sans ce saucissonnage, l’énergie serait trop importante.

 

L’ensemble respiratoire conduit au pompage de protons hors de la matrice mitochondriale et à la création d’un potentiel de membrane (= force protomotrice)

 

Ces protons sont pompés à 3 niveaux de ces complexes.

 

L’ATP est synthétisé lorsque ces protons refluent ver la matrice mitochondriale via un complexe enzymatique qui consiste en un canal.

 

v Les mitochondries, siège de la phosphorylation oxydative :

 

Il s’agit d’organites de forme ovale, dont la largeur est de 3 µm et le diamètre de 2,5 µm. Elles sont de vraies usines à énergie.

 

Chez les animaux hibernants, on observe que les mitochondries sont ratatinées, avec très peu de crêtes, très peu développées.

 

Travaux d’Albert Lehninger, 1940 :

Les mitochondries contiennent des enzymes d’oxydation d’acides gras, des enzymes d’acides citriques et des enzymes entrant dans les processus respiratoires.

 

Georges Palade, Tritjof et Sjöstrand :

Ils ont étudié la mitochondrie sous microscopie électronique. Ils découvrent que la mitochondrie est constituée de 2 systèmes membranaires :    

-          La membrane externe,

-          La membrane interne très ample et repliée en crêtes.

Et de 2 compartiments :

-          Le compartiment inter–membranaire,

-          La matrice entourée par la membrane interne.

 

L’ensemble respiratoire fait partie intégrante de la membrane interne. La membrane externe est très perméable à la plus part des petites molécules et ions, contrairement à la membrane interne qui est pratiquement perméable à tous les ions et molécules non chargées. Il existe alors un vecteur protéique spécifique pour le transport d’ADP et d’acides gras longs à travers la membrane interne.

 

v Rappel dur le potentiel d’oxydoréduction :

 

Couple Redox  :          AOxydé  +  2 eˉ  Þ  ARéduit

 

Il y a l’existence d’un potentiel Redox mesurable en utilisant des ½ cellules.

 

AOxydé  +  BRéduit  Þ  ARéduit  +  BOxydé

 

La variation de potentiel standard : DE’0  =  E’0 du couple A – E’0 du couple B

 

Le potentiel standard est transféré seulement de la forme réduite d’un couple donné à la forme oxydée d’un autre couple qui a une plus basse énergie des électrons.

Cf. page 22

 

La continuité électrique est produite par un pont d’agar (= gel)

 

Les électrons vont de la ½ cellule d’échantillon à la ½ cellule de référence (H+/H2) L’électrode de l’échantillon est négative par rapport à l’électrode de référence qui a donc 0 Volt.

 

Un potentiel Redox négatif correspond à l’affinité pour les électrons de l’échantillon plus faible que H2.

 

Un agent fortement réducteur comme le NADH+H+ a un potentiel Redox négatif, alors qu’un agent fortement oxydant comme l’O2 a un potentiel Redox positif.

Cf. page 28 (et 30)

 

Ø  Différence de niveaux de potentiel Redox dans la chaîne respiratoire :

 

½ O2  +  2 H+  +  2 eˉ  D   H2O                  E’0  =  + 0,82 V

NAD+  +  H+  +  2 eˉ  D   NADH                E’0  =  – 0,32 V

 

DE’0  =  E’0 du couple A – E’0 du couple B

          =  + 0,82 – (– 0,32)  =  + 1,14 V

Cf. page 2

 

v La chaîne des transporteurs d’électrons :

 

Elle sert à « saucissonner » l’énergie des électrons qui vont passer du NADH+H+ à l’O2 via des transporteurs :

-          Flavines,

-          Complexes Fe–S

-          Quinones,

-          Hèmes.

Ils se trouvent liés à des protéines, à l’exception des quinones. On les considère comme des groupes prosthétiques d’enzymes.

 

La 1ère réaction se fait avec la NADH–Q réductase (ou déshydrogénase) qui est composée de 16 chaînes polypeptidiques et consiste en des réactions enchaînées d’oxydoréduction.

Cf. page 24

 

FMN : Flavine Mono–nucléotide oxydée / FMNH2 : Flavine Mono–nucléotide réduite

Fe3+ : Forme oxydée du Fer / Fe2+ : Forme réduite du Fer

 

Il existe 3 types d’oxydant Fe–S :

 

-          Fe–S : 1 atome de Fer coordonné de façon tétraédrique avec 1 sulfure inorganique et les groupes SH de 4 résidus Cystéine de la protéine.

-          Fe2–S2 : 2 atomes de Fer et 2 sulfures inorganiques de plus des 4 résidus Cystéine.

-          Fe4–S4 : 4 atomes de Fer et 4 sulfures inorganiques de plus des 4 résidus Cystéine.

 

Dans la NADH–Q réductase, il y a du Fe2–S2 et du Fe4–S4.

 

Les électrons seront alors transférés à le Coenzyme–Q.

 

Le Coenzyme–Q est un dérivé quinonique avec une longue chaîne isoprénoïde, appelée aussi Ubinone avec une chaîne plus ou moins longue, parce qu’elle est ubiquitaire (partout) dans le système biologique.

Chez les Mammifères, le Coenzyme–Q contient 10 unités d’où Q10.

Sous la forme réduite, il y a une fixation de 2 atomes d’Hydrogène.

 

La particularité de ce transporteur est la présence de cette chaîne le rend fortement apolaire et lui permettant de diffuser dans la membrane mitochondriale interne. Il n’est pas lié de manière covalente à une protéine et est très mobile entre les Flavoprotéines et les Cytochromes.

 

Les électrons entrent par le NADH et par le FADH2, produits par le cycle de Krebs. La FADH2 amène ses électrons au niveau de la Succinate déshydrogénase.

Cette enzyme appartient au cycle de Krebs et est liée à la membrane mitochondriale interne. Elle est aussi un constituant du complexe Succinate Q réductase ; l’autre constituant est une protéine Fe–S.

 

Les électrons passent du FADH2 au sein de ce complexe, puis au Coenzyme–Q10.

Cf. page 4

 

Il y a aussi des électrons qui sont amener par la Glucéro_phospho_déshydrogénase ainsi que par l’Acétyl_CoA déshydrogénase au niveau du métabolisme des acides gras.

 

Les transporteurs entre le QH2 et l’O2 sont des Cytochromes et on y trouve une protéine Fe–S. Un Cytochrome est une protéine transporteur d’électrons composé d’un complexe héminique.

Cf. page 2

 

C’est l’atome de Fer qui oscille entre un état ferreux 3+ et un état ferreux 2+ pendant le transport d’électrons. Un complexe ferrique transporte 1 électron alors que les autre complexes en transfèrent 2 : un complexe QH2 transfère 2 électrons dans 2 Cytochromes.

 

Il y a 5 Cytochromes présents entre le QH2 et l’O2 :

 

-          Les Cytochromes–B et –C1 associés à une protéine Fe–S sont les composants du complexe QH_Cytochrome–C_réductase.

 

-          Le Cytochrome–C transfère les électrons de ce complexe sur le complexe Cytochrome–C oxydase. Ce dernier contient les Cytochromes–A et –A3.

 

QH2  "  Cytochrome–C Réduit  "  Cytochrome–C + Fe–S

 

Détails :

 

QH2  "  Cytochrome–B  "  Fe–S  "  Cytochrome–C1  "  Cytochrome–C 

                                                                                                     $

Cytochrome–A 

           $

Cytochrome–A3 

                                                                                                     $

O2

Cf. page 29

 

Le Cytochrome–C est une protéine extrinsèque  et hydrosoluble de la membrane. Le Cytochrome–C Réduit transfère ses électrons sur le complexe Cytochrome–C oxydase. Le rôle du Cytochrome–C est analogue au Coenzyme_Q qui est un analogue de Cytochrome–C mobile.

 

Le Cytochrome–A3 contient un atome de Cuivre, et cet atome oscille entre la forme Cu2+ et la forme Cu+. La formation de H2O fait intervenir 4 électrons alors que les groupes héminiques ne transportent qu’un électron.

 

v Couplage oxydation – phosphorylation :

 

" La théorie de Mitchell (gradient de protons)

 

Il s’agit du couplage entre la phosphorylation et l’oxydation par l’intermédiaire d’un gradient de protons.

Le flux d’électrons est un processus exergonique (= qui libère de l’énergie) :     

NADH+H+ + ½O2  D  H2O + NAD+

                                                      DG’0 = – 52,6 kCal.mol–1

 

La phosphorylation est un processus endergonique (= qui nécessite de l’énergie) :        

ADP + Pi + H+  D  ATP + H2O

                                          DG’0 = + 7,3 kCal.mol–1

 

Ø  Le gradient de protons :

 

Il faut de l’ATP synthétase mais cette enzyme n’est pas seule : le processus est réversible et assuré par l’ATPase.

 

Il y a un mouvement de protons à travers la membrane mitochondriale interne : depuis la matrice vers l’espace inter–membranaire.

[H+] de la face cytoplasmique augmente et [H+]MATRICE diminue.

 

Le transfert des électrons à travers la chaîne respiratoire a pour effet de pomper des protons de la matrice vers la face cytoplasmique de la membrane interne. Cela crée une force protomotrice qui va forcer la synthèse d’ATP par un complexe ATPasique.

Les protons vont être pompés au niveau de 3 sites lorsque les électrons vont s’écouler dans la chaîne de transporteurs.

 

Ces 3 sites sont :     Le complexe de la NADH–Q réductase,

                               Le complexe de la Q–Cytochrome–C réductase,

                               Le complexe de la Cytochrome–C oxydase.

Cf. page 1

 

3 molécules d’ATP sont synthétisées par une paire d’électrons.

La différenciation de potentiel d’oxydation–réduction entre le NADH+H+ et le Coenzyme–Q est élevée.

Cf. page 28

 

 

§  Comment l’a–t–on découvert :

 

-          Si on part du NADH+H+ comme substrat, on forme 3 ATP et si on part du succinate, on obtient 2 ATP. En effet, le Coenzyme–Q a un potentiel plus bas que celui du succinate.

 

-          Si on part d’un substrat comme l’acide ascorbique (substrat artificiel), il est oxydé parce que ses électrons entrent au niveau du Cytochrome–C, avec un potentiel plus bas que le second site. Il y a formation d’un seul ATP.

 

 

  Le rapport :  P/O :

=  Nombre de phosphate inorganique, Pi, que la cellule a ingérée sous la forme organique dans l’ATP par atome d’Oxygène consommé.

=  Index de phosphorylations oxydatives (dites aussi corporatives)

 

Pour le NADH+H+  :  P/O = 3

Pour le FADH2  :  P/O = 2

Pour l’acide ascorbique  :  P/O = 1

 

 

Du NADH+H+ au Coenzyme–Q  :           DG’0 = –12,2 kCal.mol–1,

Du Cytochrome–B au Cytochrome–C  :  DG’0 = –9,9 kCal.mol–1,

Du Cytochrome–A à l’O2  :                      DG’0 = –23,8 kCal.mol–1,

 

Il faut au moins un DG’0 = –7,3 kCal.mol–1 pour former une mole d’ATP.

 

 

Les transferts des électrons du Coenzyme–Q au Cytochrome–B et du Cytochrome–C au Cytochrome–A libèrent des énergies trop faibles pour servir à la formation d’ATP.

 

§  Inhibition du flux d’électrons :

 

-          Elle se fait en des points particuliers et avec des inhibiteurs comme le Roténone ou l’Amytal. Ceux–ci inhibe le transfert des électrons à l’intérieur du complexe de la NADH–Q réductase (site I)

" Ces 2 inhibiteurs n’interfèrent pas avec l’oxydation du succinate.

 

-          Un autre inhibiteur comme l’Antimycine A va bloquer le flux d’électrons entre le Cytochrome–B et le Cytochrome–C1.

Il bloque alors la synthèse d’ATP au niveau du cycle II et peut être contourné par l’ajout d’ascorbate (ou vitamine A) Il s’agit d’un substrat artificiel qui va directement réduire le Cytochrome–C1.

 

-          Le cyanure va, quant à lui, bloquer le flux entre le Cytochrome–A3 et l’O2. la phosphorylation de se fera pas.

De même, la cyanide et l’oxyde de carbone vont inhiber le site III, la première par une action sur la forme stérique et le second par inhibition de la forme ferreuse.

 

-          On peut synthétiser in vitro des systèmes de vésicules contenant chacune un seul site. Ce sont des vésicules phospholipidiques contenant de l’ATPase et reconstituant les sites de pompages de protons.

L’addition d’un substrat oxydable à ces vésicules conduit à la formation d’une force protomotrice suffisante pour la synthèse d’un ATP par paire d’électrons.

 

Que se passe–t–il quand on bloque l’un des sites ?

" Les transporteurs à l’amont du blocage restent sous la forme réduite et tous ceux qui sont à l’aval sous forme oxydée.

 

Ø  Orientation asymétrique des complexes transmembranaires :

 

C’est cette particularité qui permet la formation d’un gradient de protons. Elle a été découverte par une technique d’isolement par ultrason (la sonication) causant la fragmentation des structures.

 

La surface externe de ces fragments correspond à la surface matricielle de la mitochondrie. Les 2 surfaces de la membrane interne sont accessibles (surface cytoplasmique et surface matricielle)

 

On utilise différentes approches pour déterminer les dispositions des composants protéiques : utilisation d’enzymes protéolytiques (protéases), d’antibiotiques spécifiques, de lectines (reconnaissance de polysaccharides) et de marqueurs.

 

" Les sous–unités 2, 5 et 6 de la Cytochrome–C oxydase peuvent être marquées uniquement du coté matriciel. La Cytochrome–C oxydase se lie directement au Cytochrome–C sur la face cytoplasmique uniquement et la pompe à protons fonction dans une seule direction.

 

Les 3 site de conservation de l’énergie traversent la membrane interne et sont orientés de façon asymétrique.

Cf. page 31

 

Au microscope électronique, on observe l’existence de « projections F1 » à la surface des fragments.

 

Si on traite ces fragments par l’urée, les particules perdent leur projection F1. Ces particules peuvent toujours transporter des électrons mais ne peuvent plus former de l’ATP. Si on leur remet les projection F1, elles peuvent de nouveaux assurer la synthèse d’ATP.

 

Les transporteurs subissent une réduction et une oxydation mais au même moment.

 

À l’intérieur, il y a formation de molécules H2O. À l’extérieur, il y a un relargage des protons.

 

Ø  Origine des protons :

 

Une paire d’électrons va traverser la membrane plusieurs fois.

Lors de la réduction, les transporteurs dont la réduction et l’oxydation implique une protonation et une déprotonation (NADH+H+, FADH2, QH2) vont acquérir des protons à partir de l’eau et du substrat à la surface matricielle de la membrane interne.

Lors de l’oxydation, ils vont libérer les protons à la surface externe et constituer ainsi un gradient de protons.

Cf. page 34

 

Ø  Synthèse d’ATP :

 

Elle se fait lors du retour des protons vers la matrice. L’enzyme responsable se présente à la surface des mitochondries sous forme d’une protubérance sphérique de 45 Å et de 60 kDa.

 

Dans les mitochondries intactes, ces protubérances sont sur le coté matriciel de la membrane interne. Elles peuvent être détachées par agitation mécanique, ces fragments délétés vont pouvoir transférer des électrons mais plus synthétiser de l’ATP.

Cf. page 33

 

Dans ces sphères, il existe un facteur de couplage F1 qui a pour rôle de catalyser la synthèse d’ATP. Quand F1 se trouve libre dans une solution (sans gradient de protons), li se comporte comme une ATPase.

 

Il existe une autre unité F0 qui correspond à un segment hydrophobe de 4 chaînes et qui se comporte comme un canal protonique.

 

Il existe une tige qui réunit F0 et F1. Elle est constituée de plusieurs protéines dont une confère sa sensibilité à l’oligomycine qui peut bloquer la synthèse d’ATP en interférant avec l’utilisation du gradient de protons.

Cf. page 35

 

En traversant F0, du coté cytoplasmique vers le coté matriciel, le flux de protons permet la synthèse d’ATP au niveau de F1.

 

v Les systèmes de transports mitochondriaux :

Ø  Pénétration des électrons de NADH+H+ cytoplasmique :

 

Les mitochondries intactes sont imperméables au NADH+H+ et NAD+.

 

Or le NADH+H+ est formé pendant la glycolyse (oxydation du glycéraldéhyde_3_phosphate) et le NAD+ doit être régénéré pour que la glycolyse puisse continuer.

"  Les électrons du NADH+H+ sont alors transportés à travers la membrane mitochondriale par le gycérol_3_phosphate qui traverse facilement la membrane externe.

 

Pour cela, il existe une navette du gycérlo_3_phosphate qui fonctionne en 2 étapes :

 

1ère étape : Il s’agit du transfert des électrons du NADH+H+ vers le dihydroxyacétone_phosphate. Cette réaction a lieu dans le cytoplasme et met en jeu une enzyme : le glycérol_3_phosphate déshydrogénase.

 

2ème étape : Il s’agit de la régénération du dihydroxyacétone_phosphate qui a mis en jeu une déshydrogénase liée à la membrane interne : l’enzyme à FAD.

Le dihydroxyacétone_phosphate diffuse à l’extérieur des mitochondries vers le cytosol pour faire une boucle et compléter la navette.

Cf. page 36

 

NADH+H+  +  déshydrogénase à FAD          "        NAD+  +  Enzyme à FAD

   cytoplasmique            mitochondriale                          cytoplasmique          mitochondriale

 

 

La flavine réduite transfère ces électrons à la chaîne réduite (qui se fait au niveau des la Coenzyme_Q)

Il y a la synthèse des 2 ATP quand le NADH+H+ cytoplasmique est transporté par le glycérol_3_phosphate.

 

Il y a 1 ADP pour 2 électrons transférés.

 

Ce type de navette est très actif dans un muscle en mouvement répété permanent (par exemple le muscle du vol chez les insectes)

 

Il existe une autre navette dans le cœur ou le foie : la navette malate–asparate. 2 électrons cytoplasmiques sont transportés avec la mise en jeu de 2 transporteurs et 4 enzymes.

 

Les électrons du NADH+H+ du cytosol sont transférés au malate qui traverse la membrane mitochondriale interne. Puis il est réoxydé en oxaloacétate.

Ce dernier ne traverse pas facilement la membrane interne, donc il est transformé par transamination en aspartate qui peut traverser cette membrane.

Cf. page 37

 

NADH+H+    +     NAD+        D        NAD+    +    NADH+H+

        cytoplasmique       mitochondrial         cytoplasmique         mitochondrial

 

Cette réaction est très réversible donc le transfert ne se fait que si le rapport NADH+H+/ NAD+ est plus élevé dans le cytoplasme que dans la matrice mitochondriale.

 

Ø  Entrée d’ADP dans les mitochondries :

 

L’entrée d’ADP nécessite la sortie d’ATP. Ces molécules ne diffusent pas librement, il faut donc un vecteur spécifique.

 

Celui–ci assure un couplage des flux d’ATP et d’ADP : l’ADP ne rentre que si l’ATP en sort et vice–versa. Il s’agit d’un mécanisme de diffusion facilitée par un échange qui met en jeu une ADP–ATP translocase (= enzyme formée de 2 sous–unités abondantes dans la membrane mitochondriale interne)

 

L’ADP du coté cytoplasmique de la membrane est transféré préférentiellement à l’ATP.

                   [ATP]

Le rapport              [Pi] est 10 fois plus élevé sur le coté cytoplasmique que sur le coté matriciel.

                   [ADP]

 

 

Ce transport est dépendant du gradient de protons. La translocase peut être inhibée par des agents comme l’astractyloside (de nature végétale) qui empêche l’entrée d’ADP et arrête donc la phosphorylation.

 

Ø  Le transport des ions et métabolites :

 

En dehors des transporteurs principaux pour les navettes, il existe de nombreux transporteurs d’ions et de molécules chargées :

 

-          Les transporteurs dicarboxyliques : ils assurent la diffusion facilitée par échange du malate, fumarate, succinate et du phosphate.

 

-          Les transporteurs tricarboxyliques : ils assurent la diffusion facilitée du citrate.

 

-          Les transporteurs pyruvate : ils assurent la diffusion facilitée par échange du pyruvate par échange avec des OHˉ.

 

-          Les transporteurs glutamate : ils assurent la diffusion facilitée par échange du glutamate et de l’aspartate.

 

-          Les transporteurs d’ion Calcium Ca2+ : ils permettent l’accumulation dans la matrice mitochondriale grâce à l’énergie la force protomotrice (transport de protons)

Cf. page 37

 

v Bilan de l’oxydation complète du glucose :

 

Le glucose est complètement utilisé grâce à 36 ADP, 36 Pi, 36 H+, 6 O2 et donne 6 CO2, 36 ATP, 42 H2O.

 

32 ATP sur 36 sont formés par la phosphorylation oxydative.

Cf. page 38

 

Si on mesure la variation d’enthalpie libre standard de l’oxydation du glucose :

                        DG’0 = –686 kCal.mol–1

Glucose + 6 O2           "        6 CO2  +  H2O

 

Or, pour un ATP : DG’0 = –7,3 kCal

 

Donc :        36 ATP x –7,3 kCal = 263 kCal

 

Cela présente un rendement élevé : 263/686 = 38 % du potentiel total est contenu dans la molécule de glucose.

 

v Régulation de la phosphorylation :

 

La teneur en ADP est un facteur qui assure le contrôle de la phosphorylation oxydative.

 

Les électrons ne vont s’écouler des molécules énergétiques vers l’O2 que si de l’ATP a besoin d’être synthétiser.

 

 

v Inhibiteurs de la phosphorylation oxydative :

 

-          Inhibiteurs du transport d’électrons :

Exemples :

-          Amytal,

-          Antimycine A,

-          Cyanure.

Il n’y a pas de création de force protomotrice, donc pas de formation d’ATP.

 

-          Inhibiteurs de la phosphorylation oxydative :

Exemples :

-          Oligomycine.

L’inhibition se fait au niveau de la F1 en bloquant de façon indirecte le transport d’électrons.

 

-          Agents découplants :

Exemples :

-          Inhibiteurs cycliques comme la gramicidine ou la DNP.

Ils dissipent le gradient de protons en permettant le transport d’électrons sans phosphorylation oxydative.

 

Ces agents découplants sont utilisés comme moyen de produire de la chaleur pour maintenir la température chez les animaux en hibernation, les nouveaux né et les animaux vivants sur la banquise.

 

 

Les tissus adipeux dits « bruns » sont très riches en mitochondries et spécialisés dans le processus de thermogenèse car les acides gras agissent comme découplants dans ce tissu.

 

La normadrénaline contrôle la libération des acides gras. Le degré de découplage de la phosphorylation dans ce tissu adipeux est sous contrôle hormonal.

 

 

Les mitochondries servent de générateur ATP (comme des mini fourneaux)

 

 

 

Il existe des cas rares en médecine de mécanisme de découplage :

 

" Une femme était incapable de travailler longtemps. Elle présentait un fonctionnement thyroïdien normale mais un métabolisme plus du double de la normale.

 

En fait, ses mitochondries avaient une structure atypiques et n’étaient pas sous le contrôle repisratoire. Le NADH+H+ oxydé est indépendant de l’ADP présent.

Le rendement P/O était supérieur à la normale et la plus grande part de l’énergie était convertie en chaleur plutôt qu’en ATP.

 

 

La voie des pentoses

 

v Introduction :

 

Pour former des macromolécules relativement grosse comme l(ATP, il faut du pouvoir réducteur comme le NADPH+H+.

 

Ce mécanisme a été découvert par les chercheurs Arburg, Dickens, Upmann, Hurecker, Racker. Mais les principaux chercheurs qui ont établi la voie de la glycolyse sont Embden et Herverhof.

 

La glycolyse exige l’aérobiose durant l’étape initiale et comporte une décarboxylation du glucose.

Dans cette voie métabolique, différents pentoses apparaissent.

 

Elle est dite voie des pentoses (ou Shunt des pentoses, ou voie des hexoses mono–phosphatés ou encore voie oxydative du phosphogluconate)

 

v Réaction de la voie des pentoses :

 

Le point de départ est le glucose_6_phosphate.

Sa fonction pseudo–aldéhyde est dans un 1er temps oxydée en fonction acide.

 

Dans la levure de bière, on a mis en évidence une enzyme respiratoire, la glucose_6_phosphate déshydrogénase, qui a pour coenzyme le NADP+.

 

1ère étape :

Cf. page 41

 

Il y a une oxydation du glucose_6_phosphate qui donne un pseudo–aldéhyde : la 6_phosphogluconolactone.

Celle–ci est ensuite hydrolysée en acide 6_phosphogluconique.

 

2ème étape :

Cf. page 41

 

Cet acide subit une déshydrogénation par l’enzyme 6_phosphogluconate déshydrogénase.

" La déshydrogénation porte sur le carbone 3 de l’acide 6_phosphogluconique.

 

Cela donne une molécule intermédiaire : l’acide 6_phospho_3_cétogluconique.

 

Ce dernier est ensuite transformé en un cétopentose : le ribulose_5_phosphate par décarboxylation.

 

3ème étape :

Cf. page 41

 

Il y a une transformation du ribulose_5_phosphate en ribose_5_phosphate sous l’action de la phosphopentose isomérase.

 

Le ribose_5_phosphate est un aldopentose qui sert dans l’élaboration des nucléotides mais peut aussi être épimérisé en xylulose_5_phosphate.

 

Les enzymes transcétolases et transaldolases :

Cf. page 42

 

                   C5   +   C5     D     C3   +   C7

 

L’ose qui donne une partie à 2 ou 3 carbones est toujours un cétone et l’accepteur est toujours un aldose (par une transcétolase)

 

Les C3 et C7 (triose et septulose) peuvent être transformés en C6 et C4 par une transaldolase.

Cf. page 42

 

                   C5   +   C4     D     C3   +   C6

 

Les molécules de fructose_6_phosphate (C6) peuvent ensuite être transformées en glucose_6_phosphate sous l’action d’une enzyme : la phosphohexo–isomérase.

 

v Bilan de la voie des pentoses :

 

                   C5   +   C5     D     C3   +   C7     D     C6   +   C4

 

                   C5   +   C4     D     C3   +   C6

 

Cette série de réactions nécessite l’intervention de 3 molécules pentose_phosphates.

Cf. page 43

 

Le triose_phosphate entre ensuite dans la glycolyse pour donner de l’acétyl_CoA qui rentrera dans le cycle de Krebs.

 

Sous l’action de l’aldolase, 2 triose_phosphates peuvent s’unir pour donner du fructose_1,6_diphosphate.

Sous l’effet d’une phosphatase, ce dernier se transforme en fructose_6_phosphate, qui peut passer au glucose_6_phosphate grâce à la phosphohexo–isomérase.

                                      6 H2O

6 hexose_P  +  12 NADP+     "     12 NADPH2  +  2 triose_P  +  4 hexose_P  +  6 CO2  +  PO4H3

 

              H2O

2 triose_P     "     1 hexose_P  +  PO4H3

 

 


                                      7 H2O

1 hexose_P  +  12 NADP+     "     12 NADPH2  +  6 CO2  +  PO4H3

 

 

v Signification et intérêt biologique de la voie des pentoses :

 

Le NADPH2 catalyse beaucoup de réactions :

-          Synthèse des acides gras, des stérols, des hormones, des stéroïdes,

-          Hydroxylation (Phe en Tyr)

 

Cette voie n’est pas génératrice d’énergie sous forme d’ATP, mais est utilisée par l’organisme quand il existe une nécessité de réaliser des synthèses.

 

Le pentose_phosphate est formé en excès quand un tissu a besoin d’une grande quantité de NADPH2.

 

v Régulation de la voie des pentoses :

 

Elle fournit du NADPH en quantité suffisante. Elle se fit en 2 parties : l’une oxydative et l’autre non.

 

La 1ère réaction de la phase oxydative est presque irréversible. Le taux du NADP+ détermine la régulation de cette réaction.

 

Le NADPH produit entre en compétition avec le NADP+ dans les liaisons aux enzymes.

"  Le rapport NADP+/NADPH dans le cytosol est égal à 0,014.

Il est beaucoup plus faible que le rapport NAD+/NADH (= 700)

 

Il y a un effet marqué du NADP+ sur la phase oxydative qui permet d’assurer que la production de NADPH est étroitement couplée à son utilisation dans la biosynthèse réductrice.

 

Régulation du flux de glucose_6_phosphate :

 

La cellule a beaucoup plus besoin de ribose_5_phosphate que de NADPH.

"  La majeure partie du glucose_6_phosphate est convertie en fructose_6_phosphate et en glycéraldéhyde par la voie de glycolyse.

Cf. pages 44 et 55

 

La transcétolase et la transaldolase vont convertir 2 molécules de fructose_6_phosphate et une molécule de glycéraldéhyde_3_phosphate en 3 molécules de ribose_5_phosphate par l’inverse des réactions de la voie des pentoses.

 

Si les besoins en NADPH et en ribose_5_phosphate sont à peu près équivalents :

" La réaction qui prédomine est alors la formation de 2 NADPH et ribose_5_phosphate à partir de glucose_6_phosphate par la phase oxydative de la voie des pentoses_phosphate.

 

G_6_P  +  2 NADP+  +  H2O     "     ribose_5_P  +  2 NADPH  +  2 H+  +  CO2

 

Si la cellule a besoin de plus de NADPH que de ribose_5_phosphate :

"  Le glucose_6_phosphate est complètement oxydé en CO2.

 

3 types de réactions interviennent :

-          2 NADPH et 1 ribose_5_phosphate sont formés dans la phase oxydative,

-          Le ribose_5_phosphate formé est converti en fructose_6_phosphate et glycéraldéhyde_3_phosphate.

-          Le glucose_6_phosphate est resynthétisé à partir du fructose_6_phosphate et du glycéraldéhyde_3_phosphate par la voie du gluconéogenèse.

 

6 G_6_P  +  12 NADP+  +  6 H2O     "     6 ribose_5_P  +  12 NADPH  +  12 H+  +  6 CO2

 

6 ribose_6_P     "     4 fructose_6_P  +  2 glycéraldéhyde_3_P

 


4 F_6_P  +  2 glycéraldéhyde_3_P  +  H2O     "     5 gluctose_6_P  +  Pi

 

 


G_6_P  +  12 NADP+  +  7 H2O     "     12 NADPH  +  12 H+  +  6 CO2  +  Pi

 

 

S’il y a beaucoup plus besoin de NADPH que de ribose_5_phosphate :

"  Ce dernier peut être converti en pyruvate, le fructose_6_phosphate et le glycéraldéhyde_3_phosphate s’engagent dans la voie oxydative.

 

Il y aura donc une production simultanée d’ATP et de NADPH.

 

3 G_6_P  +  6 NADP+  +  5 NAD+  +  5 Pi  +  8 ADP    

   N    

5 pyruvate  +  6 CO2  +  6 NADPH  +  5 NADH  +  8 ATP  +  8 H+  +  2 H2O

 

 

Remarque :  Il y a un retour de NAD+ et d’ADP par la voie de glycolyse.

 

 

Néoglucogenèse

 

1ers précurseurs :

-          Les acides pyruvique et lactique (intermédiaires de la glycolyse),

-          Les oses (qui proviennent de l’alimentation : fructose, mannose, galactose),

-          Les lipides et les protéines.

 

Certains tissus consomment beaucoup de glucose : le cerveau utilise 120 grammes par jour sur les 160 grammes que l’organisme consomme quotidiennement.

 

La néoglucogenèse implique des enzymes présentes dans le cytosol, sauf pour la pyruvate carboxylase qui est dans les mitochondries et la glycosyl–phosphatas qui se trouve dans le RE.

 

La voie essentielle est la formation de glucose à partir de l’acide pyruvique (= sens « inverse » de la glycolyse) Ce n’est pas exactement la réaction inverse car la glycolyse est très favorisée (D» –20 kCal.mol–1)

Cf. page 48

Dans la glycolyse :

Il y a 3 étapes irréversibles qu’il faudra contourner dans la néoglucogenèse (si on veut qu’elle soit thermodynamiquement possible)

 

Il s’agit des étapes suivantes :

                                  hexokinase

-          glucose  +  ATP   "   glucose_6_phosphate  +  ADP

                                                phosphofructose kinase

-          fructose_6_phosphate  +  ATP   "   fructose_1,6_diphosphate  +  ADP

                                                       pyruvate kinase

-          phosphoénolpyruvate  +  ADP   "   pyruvate  +  ATP

 

Dans la néoglucogenèse :

 

j La phosphoénolpyruvate va être formé à partir du pyruvate par l’intermédiaire de l’oxaloacétate.

                                                 pyruvate carboxylase

pyruvate  +  CO2  +  ATP  +  H2O    D    oxaloacétate  +  ADP  +  Pi  +  2 H+

                               pyruvate carboxylase

oxaloacétate  +  GTP    D    phosphoénolpyruvate  +  GDP  +  CO2

 


pyruvate  +  ATP  +  H2O  +  GTP    D    phosphoénolpyruvate  +  ADP  +  GDP  +  Pi  +  2 H+

 

Cette réaction est possible car DG° = +0,2 kCal.mol–1 alors que celle de la réaction catalysée par la pyruvate kinase (glycolyse) est de +7,5 kCal.mol–1.

 

Il y a consommation d’une liaison phosphate riche en énergie.

k Le fructose_6_phosphate est formé à partir du fructose_1,6_diphosphate par l’hydrolyse de l’ester phosphorique porté en carbone 1.

 

                                     fructose_1,6_diphosphatase

fructose_1,6_phosphate  +  H2O    "    fructose_6_phosphate  +  Pi

 

l

                                       glucose_6_phosphatase

glucose_6_phosphate  +  H2O    "    glucose  +  Pi

 

Cette enzyme est liée au RE et agit sur des substances du cytosol. Cette enzyme n’est pas présente dans le cerveau et les muscles. Le glucose ne peut donc pas quitter ces organes.

 

v Mécanisme de la pyruvate carboxylase :

 

Cette enzyme contient un groupement prosthétique : la biotine qui sert de vecteur CO2 activé.

 

Le COOˉ terminal de la biotine est lié à un résidu de lysine au niveau de la 2ème fonction amine de cet acide aminé.

Cet dernier est lié, à l’enzyme, par une longue chaîne flexible (semblable à la lipoamide dans le complexe lipo–déshydrogénase)

Cf. complément

 

1ère étape :

                                                           Mg2+   liaison riche en énergie

biotine–enzyme  +  ATP  +  HCO3     D     CO2~biotine–enzyme  +  ADP  +  Pi

                                                    acétyl_CoA       carboxybiotine

 

2ème étape :

                                                        Mn2+ 

CO2~biotine–enzyme  +  pyruvate    D     oxaloacétate  +  biotine–enzyme

 

Bilan :

biotine–enzyme  +  CO2  +  H+     D     CO2  +  biotine–enzyme

 

Le groupement carboxyle es lié à l’atome N1 du cycle de la biotine.

Le clivage de CO2~biotine–enzyme pour libérer un CO2 présente un DG° = –4,7 kCal.mol–1

 

La carboxybiotine transfère le CO2 sur un accepteur sans apport d’énergie libre supplémentaire.

 

La longue chaîne entre la biotine et l’enzyme permet à la biotine de se tourner d’un site actif de l’enzyme (site ATP_bicarbonate) à l’autre (site pyruvate)

 

v Régulation de la pyruvate carboxylase :

 

La biotine n’est pas carboxylée s’il n’existe pas d’acétyl_CoA liée à l’enzyme. La 2nde réaction (= formation de l’oxaloacétate) n’est pas affectée par la présence d’acétyl_CoA.

 

Le mécanisme de contrôle physiologique est l’activation de type allostérique de la pyruvate carboxylase.

 

Le produit de cette réaction (oxaloacétate) est également un intermédiaire du cycle de Krebs.

"  Un taux élevé d’acétyl_CoA indique un besoin de plus d’oxaloacétate.

 


 

S’il y a un excès d’ATP, l’oxaloacétate est consommé préférentiellement dans la néoglucogenèse.

S’il y a un défaut d’ATP, l’oxaloacétate est consommé préférentiellement dans le cycle de Krebs par condensation avec l’acétyl_CoA.


 

La pyruvate carboxylase joue également un rôle critique dans le maintient des intermédiaires du cycle de Krebs.

 

Or, les réactions du cycle de Krebs permettent aussi de puiser dans les intermédiaires du cycle pour faire des synthèses.

"  Ces intermédiaires vont devoir être remplacés. Dans ce cas, le rôle de la pyruvate carboxylase est d’approvisionner le cycle de Krebs (réaction anaplérotique)

 

v Transfert de l’oxaloacétate dans le cytosol et se transformation un phosphoénolpyruvate :

 

La pyruvate carboxylase est mitochondriale alors que les autres sont cytoplasmiques.

"  L’oxaloacétate doit être transporté en dehors de la membrane mitochondriale sous la forme de malate (navette malate)

 

-          À l’intérieur de la mitochondrie, l’oxaloacétate est réduit en malate par une malate déshydrogénase (qui a pour coenzyme le NADH),

-          Ensuite, il est transporté par un vecteur à travers la membrane mitochondriale,

-          Il est ensuite ré–oxydé en oxaloacétate par une autre malate déshydrogénase dans le cytosol et qui a pour coenzyme le NAD+,

-          Puis, il est décarboxylé et phosphorylé pour donner du phosphoénolpyruvate (PEP)

 

PEP carboxykinase

Oxaloacétate  +  GTP    D    PEP  +  CO2  +  GDP

Cf. page 48

 


6 liaisons phosphates riches en énergie sont utilisées pour la synthèse de glucose dans la néoglucogenèse.

Tandis que seules 2 molécules d’ATP sont produites dans la glycolyse (lors de la conversion du glucose en pyruvate)


 

"  Le prix supplémentaire à payer pour la néoglucogenèse est de 4 liaisons phosphates (2 ATP et 2 GTP). Ces molécules riches sont nécessaires pour contourner les réactions irréversibles et passer de DG° = +20 à –9 kCal.mol–1

 

 

v Régulation réciproque de la glycolyse et de la néoglucogenèse :

 

Une voie est inactive lorsque l’autre est très active.

 

La glycolyse et la néoglucogenèse sont toutes les 2 hautement exergoniques dans conditions cellulaires.

 

Il n’y a donc pas de barrières thermodynamiques à un tel cycle.

"  Les activités des enzymes propres à chaque voie sont contrôlées de telle façon que les 2 voies ne soient pas hautement active en même temps.

Cf. page 47

 

Par exemple :

-          L’AMP stimule la phosphofructo–kinase tandis qu’il inhibe les  la fructose_1,6_diphosphate phosphatase.

-          Le citrate à l’effet inverse sur ces enzymes.

 

 

Conséquences :


 

La phosphorylation du fructose_6_phosphate (étape limitante de la glycolyse) est activée quand la charge énergétique de la cellule est basse.

 

À l’inverse, le fructose_1,6_diphosphate est hydrolysé et la néoglucogenèse est stimulée quand la charge énergétique est élevée et quand les intermédiaires du cycle de Krebs sont abondants.


 

La pyruvate–kinase et la pyruvate–carboxylase est réciproquement régulées.

"  En effet, le fructose_1,6_diphosphate stimule et l’ATP inhibe la pyruvate–kinase. Tandis que l’acétyl_CoA stimule et l’ADP inhibe la pyruvate–carboxylase.

 

Le pyruvate est donc converti est PEP et la néoglucogenèse est favorisée quand la cellule hépatique est riche en molécules énergétiques et en ATP.

 

 

 


Lors de la digestion, il y a un passage de glucose, fructose, mannose et galactose. Ces oses pourront (dans le foie) être transformés en glucose.

 

Ils sont soit dégradés, soit utilisés pour réguler la glycémie, soit stockés sous forme de glycogène (glycogénogenèse)

 

Le foie est capable de convertir les autres oses en glucose.

 

Le fructose :

 

Il peut être phosphorylé en présence d’ADP par l’hexokinase (enzyme avec une large spécificité pour plusieurs oses) pour donner du fructose_6_phosphate.

 

Ensuite, il subit une transformation en glucose_6_phosphate par la phosphoglucose–isomérase (présente dans le foie et dans autres tissus)

 

 

Par ailleurs, en présence d’ATP et de fructokinase spécifique, le fructose peut être estérifié en fructose_1_phosphate.

 

Sous l’action d’une aldokinase, le fructose_1_phosphate est coupé en 2 trioses :

-          Le dihydroxyacétone_phosphate

-          Et le glycéraldéhyde.

 

 

Il y a une condensation de ces 2 trioses_phosphate pour former le fructose_1,6_diphosphate.

Le fructose_1,6_diphosphate est hydrolysé en fructose_6_phosphate par la phophatase.

Ce dernier est ensuite isomérisé en glucose_6_phosphate.

 

 

Résumé :

 

 

                                          ATP                ADP                Glucose_6_P

                                                                                              E

                   Fructose                                                         Fructose_6_P

 


  ATP

 


  ADP                                     Phospho_dihydroxyacétone

                                                                  E                                           Fructose_1,6_diP

                   Fructose_1_P                Phospho_glycéraldéhyde

                                                                  # ATP

                                                      Glycéraldéhyde

 

Le mannose :

 

                    ATP                   Phosphomannose–isomérase

Mannose        "        Mannose_6_P        D        Fructose_6_P        D        Glucose_6_P

 

Le galactose :

 

Un dérivé nucléotidique du glucose intervient : l’uridine_diphosphoglucose (= UDP_glucose)

Cf. page 50

 

Il s’agit d’une forme active du glucose.

 

 

                   Galactokinase

Galactose                           Galactose_1_P                                   UDP_glucose

 

                   ATP    ADP                                           Phospho–galactose–uridyltransférase

 

                                          Glucose_1_P                          UDP_galactose

                                                                                              E   UDP–Gal–4–épimérase

                                                                                         UDP_glucose

 

 

Cette réaction est utilisée pour vérifier le bon fonctionnement de la cellule hépatique.

 

 

Autres manières d’obtenir du glucose :

 

-          Par la dégradation de lipides ou d’acides aminés (mais ce n’est pas l’essentiel),

 

-          Surtout la synthèse de glucose par la dégradation de composés glucidiques.

 

 

Biosynthèse d’acides gras

 

v Synthèse d’acides gras saturés :

 

Il s’agit de la formation de graisses par des protéines et de glucides (exemple du gavage des oies)

 

Elle peut être réalisée dans la plupart des tissus mais surtout dans les tissus adipeux, la moelle osseuse, les poumons, les intestins et le foie (à activité plus réduite)

 

Le foie est le siège principal de la dégradation des acides gras.

 

Le précurseur de la biosynthèse des acides gras est une molécule à 2 carbones dérivant de l’acétyl_CoA.

 

Observations permettant cette hypothèse :

-          La plupart des acides gras naturels ont un nombre paire de carbones ;

-          Si l’on nourrit une levure avec de l’acétate comme seule source carbonée, elle est capable de croître normalement ;

-          Si l’on utilise des radioéléments pour marquer différents carbones du glucose, seuls les carbones 1, 2, 5 et 6 du glucose sont retrouvés ensuite dans les acides gras.

Or ce sont les constituants des radicaux acétyliques qui forment l’acétyl_CoA ;

-          Si l’on marque l’acide acétylique (C*H3—COOH ou CH3 C*OOH), il y a un carbone sur 2 qui est marqué sur la longue chaîne des acides gras.

 

-          Klein (1957) :  Le CO2 est indispensable à la biosynthèse des acides gras à partir de l’acétate.

-          Lymen (1959) :  La biotine est une molécule indispensable.

-          Green et Wakil (1960) :  Mise en évidence, dans les microsomes de foie, d’un système enzymatique respiratoire dans la biosynthèse d’acides gras.

Différents cofacteurs sont nécessaires :

-          ATP,

-          NADPH+H+,

-          Mn2+,

-          Biotine (= vitamine H)

 

La biotine intervient dans toutes les réactions où on a un CO2 actif qui participe aux réactions de carboxylation intermédiaires.

 

ATP  +  biotine–protéine  +   CO2    "    HOOC~biotine–protéine  +  ADP  +  Pi

 

HOOC~biotine–protéine  +  substrat    "    biotine–protéine  +   CO2~substrat

                                                      Acétyl_CoA                                        Malonyl_CoA

 

La biotine est unie à la protéine enzymatique par l’intermédiaire d’une liaison amude entre le groupement COOH de la chaîne latérale de la biotine et un groupement eaminé (= 2ème fonction amine des acides aminés basiques) d’un résidu lysine.

 

                     O                                                                               O

                    ||                                                                             ||

                     C                                                                                C

 

        HN                 NH                                         HOOC~N

           |                  |                     

        HC                 CH

           |                  |                                                                     = carboxybiotine

       H2C                CH—(CH2)4—COOH

 

                     S

 

 

Hélice de Wakil :

                               (inverse de l’hélice de Lymen = dégradation)

 

Synthèse  du malonyl_CoA :

 

Son siège de la biosynthèse dans les microsomes (cytosol) et non dans les mitochondries comme la b–oxydation.

 

Cf. page 52

Et complément : principales réactions de la synthèse des acide gras j

 

Il s’agit de la fixation d’une molécule de CO2 sur une molécule d’acétyl_CoA par l’acétyl_CoA­–carboxylase.

 

"  C’est l’étape de contrôle du cycle (comme très souvent : la 1ère réaction du cycle)

 

 

L’enzyme existe sous 2 formes :

-          Protomère inactif (4 sous–unités de 4 000 Da)

-          Polymère actif.

Chaque protomère a un site de fixation pour l’acétyl_CoA et pour l’isocitrate (=modulateurs allostériques)

 


En présence d’isocitrate, les protomères s’assemblent et forment le polymère actif (4 000 Å de long et 100 Å de large)

Quand la concentration en isocitrate devient faible, le polymère se désagrège en protomère inactif.


 

Ensuite, un transporteur de radicaux acyles différents du Co_A est associé par une liaison phosphopanthéthéine à une protéine : l’ACP (= Acyl_Carrier_Protein)

Cf. page 52

 

Les radicaux actifs vont être unis à l’ACP au niveau du SH de la phosphopanthéthéine par une liaison thioester.

 

Transfert des radicaux sur l’ACP :

 

Complément : principales réactions de la synthèse des acide gras k

Complément : principales réactions de la synthèse des acide gras l

Complément : principales réactions de la synthèse des acide gras m

 

"  Activation du groupement CH2 du malonyl par la molécule d’acétyl_ACP pour permettre la condensation du radical acétyl.

 

Dans la réaction m, les réactifs sont l’acétyl_ACP et le malonyl_ACP. On aurait pu y arriver avec 2 acétyl_ACP mais l’équilibre est défavorable.

"  Avec un malonyl_ACP, l’équilibre est favorable.

 

La réaction de condensation est favorisée par l’ATP même s’il n’agit pas directement. L’énergie est libérée lors de la décarboxylation qui accompagne la formation de l’acétoacyl_ACP.

 

Bien que le HCO3ˉ est nécessaire à la synthèse d’acides gras, son atome de carbone n’apparaît pas dans le produit.

Conséquence :  Tous les atomes de carbones des acides gras proviennent de l’acétyl_CoA.

 

 

L’acétoacétyl_ACP est ensuite réduit (hydrogéné) par la b–cétoacyl–ACP–réductase.

Complément : principales réactions de la synthèse des acide gras n

 

Complément : principales réactions de la synthèse des acide gras o

 

Complément : principales réactions de la synthèse des acide gras p

 

Le butyryl_ACP formé se condense avec une molécule de malonyl_ACP. On obtient alors un acyl_ACP à 6 atomes de carbones.

On reprend alors un nouveau cycle…

Les cycles continuent jusqu’à obtenir un C16 acyl_ACP.

La dégradation du glucose peut intervenir :

-          Dans la biosynthèse des acides gras, en étant génératrice de NADPH (voie des pentoses)

-          Avec l’acétyl_CoA dans la glycolyse.

 

La condensation de l’acétyl_ACP avec la malonyl_ACP (accompagnée d’une décarboxylation est une réaction irréversible.

C’est le facteur de sécurité pour la cellule (=processus de synthèse irréversible) qui se fait au prix d’une molécule d’ATP.

 

Les acyl_ACP intermédiaires restent fixés au système enzymatique jusqu’à ce la synthèse complète soit achevée.

 


Mécanisme de dégradation (hélice de Lymen) :

Dans la mitochondrie, il utilise le coenzymeA et le FAD et le NAD comme coenzyme de réduction.

Mécanisme de synthèse (hélice de Wakil) :

Dans les microsomes, il utilise l’ACP–SH comme transporteur et le NADP réduit.


 

On utilise l’acétyl_CoA pour la biosynthèse des acides gras. Celui–ci se forme dans les mitochondries :

-          Soit par dégradation oxydative du pyruvate,

-          Soit par dégradation de lipides,

-          Soit en provenant des protéines.

Or, la membrane mitochondriale est imperméable à l’acétyl_CoA…

 

j  Clivage de l’acétyl_CoA en acétate et CoA–SH :

 

L’acétate diffuse à travers la membrane mitochondriale. Et dans le cytoplasme :

 

                                            Acétate thiokinase

Acétate  +  ATP  +  CoA–SH    "    Acétyl_CoA  +  AMP  +  PP

 

k  Formation du citrate par condensation intra–mitochondriale d’acétyl_CoA avec l’oxaloacétate :

 

Le citrate diffuse à travers la membrane mitochondriale. Et dans le cytoplasme, il va être clivé en acétyl_CoA et oxaloacétate.

 

v Synthèse d’acides gras insaturés :

Ø  Acides gras à une double liaison (= monénoïque) :

 

Exemples :

-          L’acide palmitoléique :  9_C16 : 1

= 16 carbones avec une double liaison au niveau du carbone 9.

-          L’acide oléique :  9_C18 : 1

 

La double liaison en 9  =  double liaison cis D9–10

 

Chez les mammifères, la double liaison est faite par une enzyme oxygénase dans le foie et les tissus adipeux.

L’oxygénase sert d’accepteur de 2 électrons  et de 2 H+ provenant de l’acyl_CoA (= substrat) et du NADPH2 (ou NADH2)

 

Palmitoyl_CoA  +  NADPH+H+  +  O2    "    Palmitoleyl_CoA  +  NAD+  +  2 H2O

 

Stéryl_CoA  +  NADPH+H+  +  O2    "    Oléyl_CoA  +  NAD+  +  2 H2O

 

Chez certaines bactéries, il n’y ps d’utilisation d’O2.

 

 

Ø  Acides gras à plusieurs doubles liaisons (= poly–énoïques) :

 

Ils sont absents chez les bactéries.

Chez les mammifères, il y a des familles qui diffère par la chaîne de carbone.

 

Exemples :

-          L’acide linoléique :  9,12_C18 : 2

-          L’acide linolénique :  9,12,15_C18 : 3

-          Les acides gras essentiels (= que l’on ne peut pas les fabriquer mais ils sont apportés par l’alimentation)

-          L’acide arachidonique :  5,8,11,14_C20 : 4

C’est un médiateur des neuromessagers hormonaux dont la prostaglandine est issue de cet acide gras via les cyclo–oxygénases.

 

 

Il existe :

-          Un anti–inflammatoire qui bloque la synthèse de la prostaglandine en bloquant les cyclo­–oxygénases ;

-          Un anti–inflammatoire de type I qui pose un problème car elle agit aussi sur l’appareil gastrique (" anti–inflammatoire de type II est mieux)

 

Les dérivés de l’acide arachidonique sont des leucotrènes faits par la lipo–oxygénase.

 

Si on nourrit des rats avec une carence en acides gras insaturés, les rats ont des problèmes de croissance et de peau (rattrapés par un rapport d’acide arachidonique)

 

 

v Contrôle de la synthèse des acides gras :

Ø  Contrôle à court terme :

 

La synthèse des acides gras maximale quand le taux de glucides est grand et le taux d’acides gras est faible.

 

La concentration en citrate dans le cytosol joue le rôle de régulateur à court terme le plus important en stimulant l’activité de l’acétyl_CoA–carboxylase (enzyme qui catalyse la 1ère étape)

Le taux de citrate est généralement élevé quand l’acétyl_CoA est l’ATP sont eux–même abondants.

 

L’isocitrate–déshydrogénase (du cycle de Krebs) est inhibée par une charge énergétique élevée.

"  Donc, s’il y a un taux élevé de citrate, les unités à 2 carbones et l’ATP sont disponibles pour la synthèse d’acides gras.

 

L’effet du citrate est contre–balancé par le palmitate_CoA (abondant quant i y a un excès d’acides gras)

Ce dernier inhibe le vecteur qui transporte le citrate des mitochondries vers le cytoplasme. Il inhibe aussi la production du NADH+H+ par la glucose_6_phosphate–déshydrogénase (enzyme clé de la production du pouvoir réducteur)

 

Ø  Contrôle à long terme :

 

Il s’agit du contrôle de la vitesse de transcription et de traduction des protéines–enzymes : c’est le contrôle adaptatif.

 

Exemple :  Les animaux en jeûne puis en régime particulier :

 

On observe un taux d’acétyl_CoA–carboxylase et l’acides–gras–synthétase hépatique dans les jours qui suivent la mise en place d’un régime riche en glucide et pauvre en graisse.

 

"  Le contrôle au niveau des gènes et des enzymes.